干細(xì)胞動(dòng)員對ALI大鼠TNF-α、IL-1β及肺泡表面活性物質(zhì)保護(hù)作用分析

宋靜 張?zhí)N萍

·論著·

干細(xì)胞動(dòng)員對ALI大鼠TNF-α、IL-1β及肺泡表面活性物質(zhì)保護(hù)作用分析

宋靜 張?zhí)N萍

目的 探討骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對急性肺損傷(ALI)大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)及肺泡表面活性物質(zhì)的影響。方法 選取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組30只。2組大鼠建立ALI模型，其中觀察組模型建立后皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子(rhG-CSF)，對照組皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液。在干預(yù)后3 d、7 d和14 d每組處死10只，采用HE染色觀察各期輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)值和濕/干重比，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)TNF-α、IL-1β水平，雙重免疫熒光染色檢測BrdU和肺泡表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白A(SP-A)表達(dá)。結(jié)果 觀察組傷后3 d、7 d和14 d肺組織濕/干重比、IL-1β和TNF-α均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組傷后3d、7d和14dRAC值明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組傷后3 d、7 d、14 d BrdU和SP-A雙標(biāo)陽性細(xì)胞標(biāo)記率分別為(0.74±0.13)%、(1.40±0.23)%和(2.33±0.31)%，明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對ALI起保護(hù)作用，其保護(hù)作用涉及多種機(jī)制。

急性肺損傷；腫瘤壞死因子-α；白介素1β；肺泡表面活性物質(zhì)；大鼠

急性肺損傷(acute lung injury)是一種臨床常見的呼吸道疾病，主要是指肺內(nèi)或肺外的損傷因素直接或間接損傷肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞后導(dǎo)致肺毛細(xì)血管通透性增高，大量中性粒細(xì)胞浸潤，進(jìn)而引起肺部炎癥性損傷，其可導(dǎo)致患者向急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)發(fā)展，最后導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡[1,2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多潛能細(xì)胞，也是目前細(xì)胞或組織替代治療的種子細(xì)胞之一，其在適當(dāng)條件下可遷移至肺臟并分化為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到修復(fù)損傷的作用[3,4]，但目前對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員治療急性肺損傷的研究卻較少，其治療效果仍需做大量實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。為此，本研究探討骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對急性肺損傷大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)及肺泡表面活性物質(zhì)的影響，為臨床上治療提供了一定的依據(jù)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，250～300 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK(軍)2007-018。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組30只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性肺損傷模型建立:所有大鼠均建立急性肺損傷大鼠模型，具體方法如下：大鼠麻醉后胸背備皮，采用小型生物撞擊機(jī)進(jìn)行250 kPa撞擊，以腋中線與右側(cè)第四肋間交點(diǎn)為撞擊點(diǎn)；隨后立即注射15 mg/kg LPS(美國Sigma公司)，觀察造模情況。

1.2.2 骨髓干細(xì)胞動(dòng)員:觀察組于造模后皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明醫(yī)學(xué)生物研究所生產(chǎn))30 μg·kg-1·d-1以動(dòng)員自體骨髓干細(xì)胞，而對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)5 d，觀察并記錄動(dòng)物的死亡情況，并于動(dòng)員的第6天抽血分離獲取單個(gè)核細(xì)胞,BrdU標(biāo)記后經(jīng)靜脈注入動(dòng)物體內(nèi)。

1.2.3 標(biāo)本采集:分別于動(dòng)員后3 d、7 d、14 d以過量3%戊巴比妥鈉注射處死大鼠，將部分左肺組織于0.9%氯化鈉溶液中迅速漂洗干凈后，立即放入液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆茫Ｓ嘧蠓谓M以4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片用于病理及免疫組化，冰凍切片用于免疫熒光檢測。右肺以10 ml 0.9%氯化鈉溶液灌洗3次，收集灌洗液800 r/min離心5 min，收集上清液置入-70℃冰箱保存。

1.2.4 雙重免疫熒光染色:取冰凍切片采用免疫組化染色試劑盒進(jìn)行染色，以小鼠單克隆抗BrdU和兔抗SP-C 多克隆抗體為一抗，以FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠和TRITC標(biāo)記山羊抗兔Ig為二抗，以非特異血清代替一抗作為陰性對照，具體染色步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。加DAB顯色后在熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果并照相：呈綠色熒光的為BrdU 陽性細(xì)胞，呈紅色熒光的為SP-C陽性細(xì)胞胞漿，黃色細(xì)胞為BrdU和SP-C雙陽性細(xì)胞，所有細(xì)胞核均呈藍(lán)色熒光。

1.2.5 TNF-α和IL-1β檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測檢測肺泡灌洗液(BALF)的TNF-α和IL-1β水平，檢測儀器為酶標(biāo)儀(德國拜發(fā)儀器公司，型號(hào)為880),TNF-α和IL-1β檢測試劑盒購自上海超世生物科技有限公司，具體檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 形態(tài)學(xué)分析:將肺組織以多聚甲醛固定后作連續(xù)組織切片，HE染色后觀察組織形態(tài)學(xué)變化。同時(shí)檢測肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)、總蛋白滲出量以及肺組織濕干比(W/D)。

2 結(jié)果

2.1 2組肺組織病理變化 傷后3d，對照組肺臟組織肺泡擴(kuò)張不良，肺泡腔內(nèi)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞明顯浸潤，部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)蛋白滲出，肺泡壁增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張重血，而觀察組病變與對照組相似，但中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞較對照組減少；傷后7d，對照組仍有炎性細(xì)胞浸潤，蛋白滲出更明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血及肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)仍存在，而觀察組炎性細(xì)胞數(shù)量少，蛋白滲出程度減少。見圖1。

圖1 2組大鼠肺組織切片(HE×200)

2.2 2組肺組織濕/干重比、輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)、BALF中細(xì)胞因子含量比較 觀察組傷后3d、7d和14d肺組織濕/干重比、IL-1β和TNF-α均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組傷后3d、7d和14dRAC值明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 2組BrdU和SP-A雙標(biāo)陽性細(xì)胞比較 觀察組傷后3d、7d、14dBrdU和SP-A雙標(biāo)陽性細(xì)胞標(biāo)記率分別為(0.74±0.13)%、(1.40±0.23)%和(2.33±0.31)%，明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

3 討論

急性肺損傷主要是指各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其可造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，并導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全[5,6]。急性肺損傷的病理生理特征主要為肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)，而患者的臨床表現(xiàn)多為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫，嚴(yán)重者可發(fā)展為ARDS，甚至導(dǎo)致死亡[7]。急性肺損傷的發(fā)病原因多與肺內(nèi)損傷和肺外創(chuàng)傷有關(guān)，其損傷過程是一個(gè)涉及許多細(xì)胞活動(dòng)的復(fù)雜過程，可分為早期的組織損傷(彌散性肺泡炎)和晚期的損傷后修復(fù)(肺間質(zhì)重構(gòu))兩個(gè)過程[8]。但急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，多數(shù)認(rèn)為與炎性反應(yīng)有關(guān)，而TNF-α、IL-1β等炎性因子在這一過程中發(fā)揮著重要作用[9]。

組別濕/干重比傷后3d傷后7d傷后14dIL?1(pg/ml)傷后3d傷后7d傷后14d對照組3．51±0．743．22±0．682．73±0．81352．94±51．03285．39±33．24201．18±40．07觀察組2．74±0．522．53±0．701．93±0．68288．18±43．28190．30±28．16101．73±38．21t值2．6922．2362．3923．0616．9025．680P值<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05組別TNF?α(pg/ml)傷后3d傷后7d傷后14dRAC值(個(gè))傷后3d傷后7d傷后14d對照組134．29±21．93117．83±30．1087．57±24．179．84±0．8410．10±0．9412．26±1．81觀察組101．33±19．8275．32±14．7451．28±30．2011．24±1．0313．73±1．1315．08±1．32t值3．5264．0113．944-3．331-7．810-3．981P值<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05<0．05

組別傷后3d傷后7d傷后14d對照組0．00±0．000．34±0．090．75±0．10觀察組0．74±0．131．40±0．232．33±0．31t值-18-13．572-15．339P值<0．05<0．05<0．05

圖2 雙重免疫熒光染色

A：BrdU單染呈綠色熒光；B：SP-A單染呈紅色熒光；C：BrdU和SP-A雙染陽性呈黃色熒光

目前臨床上治療急性肺損傷的主要方式為呼吸支持和抗炎治療，但治療效果并不理想[10]。骨髓干細(xì)胞動(dòng)員是一種新興的細(xì)胞移植方法，其主要是利用細(xì)胞因子使骨髓中的干細(xì)胞進(jìn)入外周血，通過血液循環(huán)到達(dá)損傷組織，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞移植的目的[11]。有研究表明，干細(xì)胞動(dòng)員劑具有同時(shí)動(dòng)員骨髓造血干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞及內(nèi)皮干細(xì)胞的能力，而動(dòng)員后骨髓的多種干細(xì)胞均可能參與組織器官的修復(fù)[12]。目前常用的動(dòng)員劑主要有粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長因子和干細(xì)胞因子等，其中G-CSF是近年發(fā)現(xiàn)的骨髓干細(xì)胞強(qiáng)有力的動(dòng)員劑之一[13]。研究表明，G-CSF是酪氨酸激酶受體c-Kit的配體，其應(yīng)用后可使外周血的骨髓干細(xì)胞數(shù)量增高數(shù)十倍甚至數(shù)百倍，但對于骨髓干細(xì)胞動(dòng)員能否在肺內(nèi)定植并向肺上皮細(xì)胞分化并參與急性肺損傷的修復(fù)仍沒有相關(guān)的報(bào)道[14]。

為了進(jìn)一步探討骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對急性肺損傷大鼠TNF-α、IL-1β及肺泡表面活性物質(zhì)的影響，本研究利用創(chuàng)傷和LPS建立了大鼠急性肺損傷模型并分作2組，觀察組皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子(rhG-CSF)，而對照組皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液，觀察并比較2組建模后3d、7d和14d時(shí)的RAC值和濕/干重比、肺泡灌洗液的TNF-α、IL-1β水平、BrdU和SP-A水平。LPS能促發(fā)肺泡表面活性物質(zhì)減少，導(dǎo)致肺部出現(xiàn)急性肺泡滲出和中性粒細(xì)胞炎癥。本研究中2組大鼠賊傷后3d均出現(xiàn)肺臟組織肺泡擴(kuò)張不良、肺泡腔內(nèi)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞明顯浸潤部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)蛋白滲出等癥狀，但觀察組的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞較對照組減少；而傷后7d時(shí)對照組仍有炎性細(xì)胞浸潤，蛋白滲出更明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血及肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)仍存在，但觀察組的炎性細(xì)胞數(shù)量少，蛋白滲出程度減少，提示利用LPS可成功建立大鼠急性肺損傷模型，而皮下注射rhG-CSF進(jìn)行骨髓干細(xì)胞動(dòng)員后能明顯改善大鼠的急性肺損傷癥狀，其可促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)再生,并降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，觀察組傷后3d、7d和14d肺組織濕/干重比、IL-1β和TNF-α均低于對照組(P<0.05)，而RAC值明顯多于對照組(P<0.05)，提示皮下注射rhG-CSF進(jìn)行骨髓干細(xì)胞動(dòng)員可下調(diào)急性肺損傷大鼠的IL-1β和TNF-α等炎性因子的水平，進(jìn)而阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)展，并能促進(jìn)肺組織損傷的修復(fù)，但具體機(jī)制仍需作進(jìn)一步的研究。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，觀察組傷后3d、7d、14d時(shí)BrdU和SP-A雙標(biāo)陽性細(xì)胞標(biāo)記率均明顯多于對照組。SP-A是一種肺泡表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白，主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(ATⅡ)合成和分泌，具有保護(hù)高氧肺損傷作用，并在維持肺的呼吸與非呼吸功能中起著重要作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞動(dòng)員可促進(jìn)ATⅡ合成和分泌SP-A蛋白，進(jìn)而保護(hù)損傷的肺組織，改善急性肺損傷大鼠的急性肺損傷癥狀，但其機(jī)制仍需作進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對急性肺損傷起保護(hù)作用，其保護(hù)作用涉及多種機(jī)制。

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Effects of stem cell mobilization on TNF-α, IL-1β and pulmonary alveolar surfactant in rats with acute lung injury

SONGJing,ZHANGYunping.
DepartmentofSenileDiseases,FriendshipHospitalofDalianCity,Liaoning,Dalian116000,China

Objective To investigate the effects of bone marrow stem cell mobilization on tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin 1β (IL-1β) and pulmonary alveolar surfactant in rats with acute lung injury (ALI).Methods Sixty clean grade healthy male SD rats were randomly divided into observation group and control group,with 30 rats in each group.The animal models with ALI were established in the rats of both groups.After modeling the rats in observation group were given recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) by subcutaneous injection,however,the rats in control group were given the same volume 0.9% sodium chloride solution,then the 30 rats in each group were sacrificed on 3d,7d,14d after intervention,respectively,and the radial alveolar counts (RAC) at different periods and the ratio of wet/dry weight were detected by HE staining, the levels of IL-1β and TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA,and the expression levels of BrdU and pulmonary surfactant protein A (SP-A) were detected by double immunofluorescence staining.Results The ratio of wet/dry weight and the levels of IL-1β and TNF-α on 3d,7d,14d after lung injury in observation group were significantly lower than those in control group (P<0.05),however,TheRACvalueson3d,7d,14dafterlunginjuryinobservationgroupweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).TheBrdUandSP-Adoublepositivecellslabelingrateson3d,7d,14dafterlunginjuryinobservationgroupwere(0.74±0.13)%,(1.40±0.23)%,(2.33±0.31)%,respectively,whichweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).Conclusion The bone marrow stem cells mobilization has a protective effect on ALI,and its protective effect may be involved in multiple mechanism.

acute lung injury; tumor necrosis factor α; interleukin 1β; pulmonary surfactant; rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.009

項(xiàng)目來源：大連市衛(wèi)生局科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：WSJ/KJC-01-JL-01)

116000 遼寧省大連市友誼醫(yī)院老年病科

R

A

1002-7386(2017)09-1316-04

2016-12-07)