國產牛心包補片在羊肺動脈和主動脈補片實驗中的安全性和有效性

米爾阿迪力江·阿布都帕塔爾 陸樹洋 陳金淼 何 晨 王春生 洪 濤

(復旦大學附屬中山醫院心外科 上海 200032)

國產牛心包補片在羊肺動脈和主動脈補片實驗中的安全性和有效性

米爾阿迪力江·阿布都帕塔爾▲陸樹洋▲陳金淼 何 晨 王春生 洪 濤△

(復旦大學附屬中山醫院心外科 上海 200032)

目的 本研究對國產牛心包補片的安全性和有效性進行評價,為進一步臨床應用提供實驗基礎。方法采用綿羊肺動脈及降主動脈補片植入模型,以4只羊作為實驗組,在肺動脈干和降主動脈干兩處共植入8枚國產牛心包補片;以2只羊作為對照組,在肺動脈干和降主動脈干兩處共植入4枚進口牛心包補片。術前對所有動物進行常規生化檢查,術后第1個月、第2個月隨訪超聲心動圖,第3個月時進行取材,比較兩組植入補片的內皮化、炎癥和鈣化程度等。結果 (1) 所有動物均存活,未發生手術相關并發癥;(2) 超聲心動圖第1個月、第2個月的結果顯示肺動脈和主動脈補片內無縫合處漏血、無鈣化、無血栓形成、無贅生物、無明顯動脈瘤樣擴張;(3) 肉眼觀察兩組補片均無內膜增生,厚度和韌度較術前無明顯改變;兩組補片內膜光滑,均無肉眼可見的鈣化和異物。(4) 微生物學檢測提示兩組補片均未出現微生物感染,均有良好的內皮化,均有炎癥細胞浸潤,壞死、鈣化程度差異無顯著統計學意義。結論 國產牛心包補片在綿羊肺動脈和主動脈補片試驗中具有良好的安全性和有效性。

牛心包補片; 國產補片; 肺動脈/羊; 主動脈/羊

牛心包是一種優良的心血管修補重建材料,其具有良好的張力強度、適中的厚度及柔軟度、不易感染、不漏血、不必預凝、來源廣泛、價格便宜等優點,因而被廣泛應用于各種先天性和后天性心臟大血管等疾病的手術治療[1]。中國患者心血管病手術應用人工組織材料日益增加,但是國產的牛心包產品極少,大部分牛心包產品依賴從國外進口,目前批準進入中國市場的牛心包產品種類有限,因而導致牛心包來源少,價格昂貴。為了解決牛心包材料的來源和購買成本問題,生產出中國自主品牌的牛心包材料符合中國的國情需要。目前,經戊二醛處理的牛心包應用最廣泛,然而鈣化及退行性變是當今牛心包補片的最主要缺點[2]。本研究以新型國產牛心包作為補片,通過動物實驗對其安全性和有效性進行評價,為此產品進入臨床應用提供實驗依據。

材 料 和 方 法

實驗材料 欣吉特牛心包補片(Cingular patch,CP),由上海欣吉特生物科技有限公司提供。采用干片射線滅菌后用保存于0.625%的戊二醛溶液中,厚度為0.2～0.72 mm,補片大小為6 cm×8 cm。佰仁思牛心包補片(Balmedic patch,BP)購自北京佰仁醫療科技有限公司。采用化學滅菌后保存于戊二醛溶液中,補片厚度為0.2～0.6 mm。

實驗分組 2歲左右綿羊(上海匯智贏華醫療科技研發有限公司動物部),雌雄不拘,體質量40～45 kg ,共6只。其中實驗組4只,欣吉特牛心包片組;對照組2只,佰仁思牛心包片組。

實驗步驟 通過面罩吸入異氟烷誘導麻醉,氣管插管,在胃內安置胃管,綿羊右側臥位,左第四肋間切口進入左側胸腔,切開心包,顯露心臟和大血管。使用側壁鉗,夾住需要切開的肺動脈壁,人工剪出大小為3 cm×3 cm的肺動脈壁缺口,將牛心包補片裁剪成缺口大小,4-0聚丙烯縫線連續縫合,將牛心包補片縫合在肺動脈壁上。暴露降主動脈,使用側壁鉗夾住降主動脈一側,人工剪為大小為3 cm×3 cm的降主動脈壁缺口,將牛心包補片裁剪成缺口大小,4-0聚丙烯縫線連續縫合,將牛心包補片縫合在降主動脈壁上。仔細止血,置胸腔引流管1根,逐層縫合切口,布比卡因75 mg局部注射鎮痛。

術后護理 將動物放回籠內。術后5天內,肌肉注射呋塞米20 mg,2次/日,預防胸水形成;術后1周內,肌肉注射頭孢拉定2 g,2次/日,用于消炎及預防感染治療;口服華法林3 mg至植入后1個月為止,1次/日,用于抗凝治療。術后1周內每天監測綿羊的體溫、心率和呼吸頻率以及切口愈合情況。

檢測方法

生化檢查 術后第3個月,綿羊處死前采集外周血標本,檢測白細胞、中性粒細胞計數等來評估術后感染。測量國際標準化比值(international normalized ratio,INR)、血清鈣離子反應血液凝固和鈣含量。測磷酸肌酸酶、尿素、肌酐等反映術后并發癥等其他問題。

超聲心動圖 術后1個月、2個月在無麻醉狀態下進行右側臥位體外經胸超聲心動圖檢查,以獲得心臟圖像來評估植入的牛心包補片。以是否有牛心包縫合處漏血、有無鈣化、有無血栓形成、有無贅生物等來進行評價。

組織病理學 動物通過面罩吸入異氟烷持續麻醉狀態下頸動脈切割放血致死,無菌切取靠近植入端約2 cm處的一段組織,分離出牛心包補片。肉眼觀察牛心包補片有無贅生物、血腫、血栓形成、以及機械或生物的退化。取牛心包補片的代表性部分進行石蠟切片,用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,Masson染色和茜素紅染色觀察炎癥、壞死、鈣化程度,內皮化、細胞外結構,膠原纖維和彈性蛋白的聚集程度等。

結 果

實驗結果 兩組羊均存活,圍手術期未出現發熱、體質量下降等術后并發癥。整個實驗中,動物在行為學上無異常表現,食欲、體征等未明顯改變。

生化檢查 兩組白細胞、中性粒細胞計數,INR、鈣含量、肌酐和尿素等指標比較,實驗組均低于對照組,但差異無統計學意義(圖1)。血液微生物培養結果顯示,實驗組及對照組均無細菌。

超聲心動圖 術后1個月、2個月超聲心動圖顯示兩組補片肺動脈和主動脈處牛心包縫合處未見漏血,無鈣化、血栓和贅生物形成等(圖2)。兩處補片均無明顯動脈瘤樣擴張,心臟收縮活動和各瓣膜未見異常,無心包積液。

組織病理學 肉眼觀察補片可見內面光滑,厚度未見變薄,無補片內贅生物、血腫、血栓形成,無明顯的瘤樣膨出,未見補片撕裂、穿孔、鈣化、硬化,補片變形和回縮等(圖3)。

To evaluate the inflammation response of the animal,white blood cells and neutrophils in peripheral blood were tested.Meanwhile,creatinine,urea and calcium level were examined.CP:Cingular patch;BP:Balmadic patch.

After the pericardium was implanted into the artery ultrasonic cardiogram examination was taken after 2 months.A:Balmedic patch (BP) in aortic artery; B:Cingular patch (CP) in aortic artery;C:Balmedic patch (BP) in pulmonary artery;D:Cingular patch (CP) in pulmonary artery.

兩組全部標本均有良好的新生內膜覆蓋(圖4A),均有補片交界處炎性反應(圖4B)。為了量化炎性反應和壞死程度,按炎癥程度評分為0～3分:0分為無炎性反應;1分為小范圍炎性反應,炎癥范圍:0.1～0.3 mm (圖4D);2分為局部較大范圍的炎性反應,炎癥范圍:0.3～1.0 mm (圖4C);3分為有彌散性炎性反應區,炎癥區域大于1.0 mm (圖4B),兩組補片炎癥評分數實驗組略低于對照組(2.50±0.58vs.3.25±0.25),但差異無統計學意義(P=0.182,表1)。按壞死程度分評分為0～2分:0分為無壞死;1分為小范圍壞死,壞死區域小于補片的50%;2分為大范圍壞死,壞死區域大于補片的50% (圖4F),實驗組補片壞死分數等于對照組。按鈣化程度可評分為0～3分:0分為無鈣化;1分為點狀小鈣化,散在點狀微小鈣化;2分為小片狀鈣化壞死,鈣化區域小于補片的50%;3分為大范圍鈣化壞死,鈣化區域大于補片的50%,實驗組鈣化分數略低于對照組(1.25±0.50vs.1.50±0.50),但差異無統計學意義(P=0.63,表1)。上述積分規則進行統計,兩組補片總分數實驗組低于對照組(4.25±1.26vs.4.25±0.25),差異無統計學意義(P=0.35,表1)。Masson染色可以看出實驗組膠原纖維含量比對照組多,但差異無統計學意義(圖5)。茜素紅染色看到兩組全部標本均有鈣化,兩組補片鈣化程度差異無統計學意義(圖6)。

Gross look of the pericardium showedin the picture.A:Balmedic patch (BP) in pulmonary artery; B:Cingular patch (CP) in pulmonary artery;C:Balmedic patch (BP) in aortic artery;D:Cingular patch (CP) in aortic artery.

Microscopic views of extracted Cingular patches.Inflammation was restricted around the patch.A:Neointima was formed evenly with good endothelialization (A and E).B:Large amount of immune cells infiltrated in the tissue (1.0 mm < infiltration extent);C:Moderate immune response was seen in the patch (0.3 mm

表1 兩組綿羊炎癥、壞死、鈣化程度的量化Tab 1 Quantification of inflammation,necrosis and calcification in the two sheep groups

Inflammation score:0=absent;1=mild (0.1 mm

To evaluate the collagenases of the implanted patches,Masson staining of the patches were taken.A:Cingular patch (CP) at the pulmonary artery;B:Balmadic patch (BP) at the pulmonary artery;C:aortic artery of the Cingular patch (CP);D:Balmadic patch (BP) at the aortic artery.

討 論

在臨床實踐中,先天性心臟結構缺損、先天性或后天性血管發育異常等疾病多數需要人工材料進行手術修補和重建。這些修補材料有多種選擇,包括自體心包組織、動物自然生物材料(牛心包、豬心包及馬心包等)、人工合成材料等,其中應用最為廣泛的為牛心包片[3]。

A and B:spot calcification;;C:moderate calcification with necrosis of the patch;D:severe calcification and necrosis.Microcalcification grades:0=absent,1=spot calcification,2=mild calcification (<50% of the patch),3=marked calcification (≥50% of the patch).

牛心包片有很好的組織相容性。處理后的牛心包片為無細胞的膠原結構,這為宿主細胞遷移和增生、內皮化和組織再生提供了天然的微環境。本研究中的兩組牛心包片肉眼觀察補片內面光滑,厚度未見變薄,無補片撕裂、穿孔,未見血栓形成、贅生物等。另外,牛心包容易制造并加工成0.5 mm厚度均一的補片,提供可靠的縫線滯留,縫線部位不易漏血,順應性與自體動脈非常相似,這些特點使得牛心包片具有與自體組織高度的一致性[4]。本實驗補片植入術后2個月心超可見兩組牛心包片縫合處均未漏血和瘤樣擴張、無鈣化、硬化,補片變形和回縮等。可見牛心包片作為人工生物材料具有安全性。

當補片植入后,與原組織發生免疫反應,炎性細胞侵入,各種細胞如免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞等移行至植入補片內,使補片細胞化,促進補片新生內皮的形成。內皮細胞在維護組織正常結構和生理功能方面起著重要作用。正常自體組織表面覆蓋一層完整的內皮細胞,阻止血漿蛋白的滲入和血栓形成,使血中游離的鈣離子不能在膠原組織中沉積,并且有營養和自身修復作用[5]。通常,補片植入后第30天左右開始內皮化,3個月左右完全內皮化。因此本實驗隨訪至術后第90天。實驗結果顯示兩組補片均有完整的內皮化、新生內膜生成。當補片內皮化完成、新生內膜出現后,血栓形成、內膜感染及瘤樣擴張的機率明顯減少,從而延長補片壽命,減少并發癥[6-7]。欣吉特牛心包采用內皮化處理技術,補片內皮化處理后可促進其完全內皮化,防止血栓和贅生物的形成。缺乏內皮細胞的襯被與覆蓋,這是導致補片鈣化和退變、耐久性差的主要原因之一。Guldner等[8]報道,內皮化處理能明顯改善補片鈣化,促進新生內膜的形成,增強其組織相容性和使用壽命。因此內皮化對生物補片有重要意義。

修補材料作為外源性的異體植入物,存在潛在的免疫反應和潛在的感染風險。牛心包有其自身的特點,主要由膠原纖維、彈性纖維和多種結締組織成分組成,含量最多的是膠原,其中又以Ⅰ型膠原為主[9]。膠原作為醫療器械產品最重要的特點在于與其他具有免疫原性的蛋白質相比,它是大分子物質,但結構重復性大,免疫原性較低[10-11]。因此,牛心包片植入體內后不會發生嚴重的免疫反應。本研究的生化結果顯示,兩組外周血與炎癥免疫有關的白細胞、中性粒細胞計數,INR、肌酐和尿素等指標都無明顯增高,欣吉特補片組略小于對照組,差異無統計學意義。除了牛心包有其自身較低的抗原性的特點,商業化的牛心包都予以戊二醛處理,降低了其抗原性。牛心包戊二醛處理后封鎖了其抗原性基團抑制免疫排斥反應,減少了血栓形成,降低了感染風險。0.625%戊二醛交聯處理不僅可以殺菌,而且可增加生物組織膠原蛋白分子間的交聯,掩蓋生物組織的抗原部位和中和生物組織表面的正電荷,從而增加生物組織的穩定牢固性,使牛心包機械強度明顯提高;同時也去除了大量的可溶性蛋白、黏多糖和糖蛋白、膠原纖維的交聯,掩蓋和封鎖了抗原性基團,抑制免疫排斥反應,減少了血栓形成[12-13]。本實驗補片亦用0.625%戊二醛交聯處理,可見補片與原組織交界處均有免疫炎性反應,可見到免疫細胞浸潤、少量的組織壞死鈣化形成。欣吉特牛心包片相對于對照組炎癥、壞死程度小,差異無統計學意義。降低生物材料的抗原性,可降低免疫排斥反應、促進補片的內皮化,并減少補片內壞死、鈣化的形成,增強補片組織相容性和使用壽命。

然而,人工修補材料缺乏組織重塑、再生和生長,這對于年輕或幼兒患者來說,隨著時間的延長將增加再次手術的風險[14]。動物生物材料牛心包、豬心包等,尤其是戊二醛處理過的心包組織在年輕病人中有出現補片的硬化、鈣化等改變[15-16]。本研究中的兩組牛心包片均有鈣化的改變,欣吉特牛心包片相對于對照組鈣化程度小,但差異無統計學意義。許多研究報告顯示,牛心包補片均出現鈣化,采用脫細胞措施或特殊的抗鈣化處理后的牛心包組織鈣化程度變小,但仍未徹底防止補片鈣化[17],因此生物材料鈣化機制研究以及抗鈣化的處理措施是有待需要解決和改進的重點所在。因此本研究中,實驗組欣吉特牛心包補片在其準備過程中,使用射線干性滅菌法減少化學滅菌過程中對組織結構的損害以及化學試劑的毒性作用,從而減少滅菌處理過程可能引起的補片鈣化。雖然牛心包作為人工生物材料有其有效性和安全性,但補片鈣化、退變問題尚未完全解決,補片內皮化、抗補片鈣化和退變是以后人工生物材料使用壽命關鍵所在。

欣吉特心包補片作為新型國產牛心包補片,在綿羊肺動脈和主動脈補片試驗中具有良好的安全性和有效性,不亞于進口的佰仁思牛心包補片,有望解決補片來源問題。

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Safety and effectiveness of domestic bovine pericardium as ovine pulmonary artery and descending aorta patch

MIERADILIJIANG Abudupataer▲, LU Shu-yang▲, CHEN Jin-miao, HE Chen, WANG Chun-sheng, HONG Tao△

(DepartmentofCardiacSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To evaluate the safety and effectiveness of a newly domestic bovine pericardium using a juvenile sheep model and to provide proof for clinical use. Methods Under the off-pump condition,8 domestic bovine pericardiums were implanted into the pulmonary artery and the descending aorta of 4 juvenile sheep as the trial group.As the control group,four imported bovine pericardiums were implanted into two juvenile sheep．Before the surgery,the juvenile sheep were given a physical examination and some laboratory tests.Ultrasonic cardiographs were taken after 1 month and 2 months of implantation.Sheep were sacrificed after 90 days and compared with the extent of endothelialization,inflammation and calcification of the two groups. Results (1) All the juvenile sheep survived without any complications.(2) Ultrasonic cardiograph showed the absence of leakage,thrombus,calcification,neoplasm or any structural deterioration.(3) Gross examination showed there was no intimal hyperplasia.The thickness and tenacity of all patches had no change compared with the pre-operation condition．All the patches showed smooth and pliable faces without degeneration,as well as absence of macroscopically calcification.(4) There was not any positive result in microbiological tests in both groups.The degree of inflammation,necrosis and calcification had no significant differencs between the two groups. Conclusions The data shows that the domestic bovine pericardium,a newly developed Chinese domestic-design and manufactured bovine pericardium,can exhibit long-term satisfactory safety and efficacy in the implantation of the pulmonary artery and the descending aorta of juvenile sheep.

bovine pericardium; domestic patch; pulmonary artery/sheep; aorta/sheep

國家自然科學基金(81501595)

R654.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.02.014

2016-08-15;編輯:沈玲)

▲MIERADILIJIANG Abudupataer and LU Shu-yang contributed equally to this work

△Corresponding author E-mail:hong.tao@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81501595).