蛇床子素固體脂質納米粒的體內抗腫瘤活性研究

陳嬌婷　葉民珠

[摘要]目的：制備蛇床子素固體脂質納米粒（ost-SLN），并考察ost-SLN體內的抗腫瘤活性。方法：采用熔融-勻化法制備蛇床子素固體脂質納米粒，評價Ost-SLN對小鼠H22肝癌實體瘤的抑瘤作用，觀察對脾、胸腺等器官的損傷情況，比較不同濃度下對機體帶來的影響。結果：ost-SLN可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，而且隨著給藥濃度增加，ost-SLN的抑瘤率均上升，分別為34.2%、50.9%、68.5%。結論：ost-SLN在體內均有明顯的抗腫瘤活性，且未出現毒性反應，有望開發成一種高效、低毒的蛇床子素制劑。

[關鍵詞]蛇床子素；ost-SLN；抗腫瘤

蛇床子素（osthol，osc）是從傘形科植物蛇床的果實中提取分離得到的一種香豆素類化合物，其核心結構由苯環和吡喃酮環組成。藥理研究表明，蛇床子素對心血管系統、中樞神經系統、免疫系統等有重要活性，且在抗腫瘤、抗骨質疏松癥及抗變態反應等方面也均有較強的效果。但由于蛇床子素在水中難溶，口服吸收差，生物利用度低，個體差異大，限制了其在臨床上的廣泛應用。研究采用熔融-勻化法制備蛇床子素固體脂質納米粒，建立小鼠H22肝癌實體瘤模型，評價蛇床子素固體脂質納米粒對小鼠H22肝癌實體瘤的抑瘤作用，觀察對脾、胸腺等器官的損傷情況，比較其不同濃度下對機體帶來的影響和可能產生的毒副作用，為蛇床子素固體脂質納米粒的進一步臨床研究奠定基礎。

1.儀器與材料

1.1儀器 Sartorius ALC4100電子天平（廣州市上博電子科技有限公司）；85-2型數顯恒溫磁力攪拌器（鞏義市科瑞儀器有限公司）；NIROSOAVI高壓乳勻機（美國儀器集團）；高效液相色譜儀（日本島津）；高分辨透射電鏡（81W/AIS2100，西化儀器有限公司）。

1.2試藥 蛇床子素（批號：110822-200406，南京替斯艾么中藥研究所）；單硬脂酸甘油酯（批號：054K5303，上海凌峰化學試劑有限公司）；大豆卵磷脂（批號：2075523，上海愛康精細化工有限公司）；泊洛沙姆188（批號：WPWA544C，南京威爾化工有限公司）；無水乙醇（批號：20110528，上海化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，山東浩中化工科技有限公司），其余試劑均為分析純。

1.3動物與瘤株 昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，清潔級，動物合格證號：JxA2005318，由贛南醫學院實驗動物中心提供。肝癌細胞H22由贛南醫學院藥理實驗室提供。

2.方法

2.1蛇床子素固體脂質納米粒的制備 采用熔融-勻化法制備，稱取處方量的單硬脂酸甘油酯在（75±2）℃加熱熔融后，蛇床子素用適量無水乙醇溶解后，兩者均勻混合作為油相。取處方量的大豆卵磷脂、泊洛沙姆188、水在超聲中溶解，并加熱至（75±2）℃成為水相。在攪拌下將水相緩慢滴加到油相中，制成O/W型初乳。用高壓乳均機在100 MPa壓強下，于（75±2）℃下反復乳勻5次后，迅速冷卻形成蛇床子素固體脂質納米粒混懸液。

2.2納米粒的質量評價

2.2.1ost—SLN的形態學觀察及粒徑分布形態學觀察 按照最佳方案制備的ost-SLN，采用電子顯微鏡觀察。將ost-SLN樣品，用水稀釋至適當濃度，用激光散射粒度測定儀測定其粒徑。

2.2.2包封率的測定 采用超速離心法，精密量取蛇床子素固體脂質納米粒1mL，置離心管，于10000r/min離心30min。取上清液用甲醇定容于10mL量瓶，經孔徑0.45um微孔濾膜濾過，備用。在此色譜條件（色譜柱：C18柱；檢測波長：322nm；流動相：甲醇-水（75：25）；柱溫：室溫；流速1mL/min）測定游離藥物濃度。

精密量取蛇床子素固體脂質納米粒lmL，置10mL量瓶，用甲醇定容，超聲處理，靜置，經孔徑0.45um微孔濾膜濾過，備用。采用上述色譜條件測定蛇床子素固體脂質納米粒中總藥量，并根據公式計算包封率。包封率（%）=[（總藥量-游離藥物量）/總藥量]×100%。

2.3體內抗腫瘤活性研究

2.3.1小鼠肝癌細胞H22荷瘤小鼠模型制備 H22瘤株經小鼠腹腔7d傳代1次，取第3代用于實驗，腹水瘤小鼠脫頸椎處死，無菌條件下用一次性無菌注射器抽取乳白色腹水，置于已滅菌的離心管中，細胞計數器計數，用無菌生理鹽水稀釋成1×10個/mL的腫瘤細胞懸液，接種于小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2mL。

2.3.2Hz2肝癌小鼠分組及給藥 接種次日隨機分組，每組10只，雌雄各半。分組后立即腹腔注射給藥，藥量經預實驗確定，每天用藥1次，連續8d。分組及給藥量分別為：模型組為生理鹽水，對照組環磷酰胺組（20mg/Kg），分別用Ost、Ost-SLN的低、中、高劑量組為用藥組。藥物3個劑量組為1.0、2.0、4.0mg/Kg，每只給藥0.2mL/d。

2.3.3檢測指標末次給藥后24h（禁食不禁水），后頸椎脫臼處死各組小鼠，完整剝離腫瘤并稱重，計算抑瘤率。剖取胸腺和脾臟，計算臟器指數。

抑瘤率=（模型組平均瘤質量-用藥組平均瘤重）/模型組平均瘤質量×100%。

脾臟或胸腺指數/mg/g=脾臟或胸腺重量/體重。

2.4統計學方法 采用統計學軟件SPSS 13.0進行數據分析。計量資料以均數加減標準差（x±s）表示，行t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

3.結果

3.1納米粒的質量評價 在電子顯微鏡照片中顯示，ost-SLN大都呈規則、完整的圓形或卵圓形，粒子分散狀態良好，無粘連。形態學圖見圖1。平均粒徑分布范圍為100～200nm，分布比較均勻。粒徑分布圖見圖2。測得其包封率為59.78%。

3.2體內抗腫瘤活性研究

3.2.1小鼠瘤重的影響 ost-SLN用藥組對H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制率達到了34.2%，與模型組比較抑瘤效果有統計學差異（P<0.05）。隨著給藥濃度增加，藥物的抑瘤率均上升，分別為34.2%、50.9%、68.5%。ost-SLN可以增強ost對小鼠腫瘤的抑制作用，反映了其在體內良好的靶向分布和抗腫瘤活性。見表1。

3.2.2胸腺指數和脾指數比較 各組小鼠處死時體重變化與對照組比較，發現用藥組中不同劑量可見ost-SLN組對小鼠體重的抑制作用較小，這應當與其在體內的靶向性分布，減少藥物在其它組織和細胞中的分布有關。用藥組中荷瘤小鼠的胸腺指數和脾指數都比模型組的免疫指數略大一些。見表2。

4.討論

實驗中采用熔融一勻化法制備ost-SLN樣品，將載藥類脂熔融物分散于熱的乳化劑水溶液中形成初乳，初乳經高壓乳均機勻質形成納米乳，室溫下冷卻固化形成SLN。該法得到的SLN粒徑小且分布窄，但高溫會增加藥物和載體的降解速度。為進一步考察蛇床子素的抑瘤活性，實驗進行了蛇床子素對荷瘤小鼠抑瘤活性的研究和對脾、胸腺等器官損傷情況的考察，觀察其給藥劑量下對機體帶來的影響和可能產生的毒副作用，以揭示其在臨床腫瘤治療中潛在的應用前景。

實驗結果顯示，環磷酰胺和ost-SLN可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，其中隨著給藥濃度增加，ost-SLN的抑瘤率均上升，分別為34.2%、50.9%、68.5%。表明其在體內良好的靶向分布和抗腫瘤活性；且高濃度的ost-SLN的抑瘤率比環磷酰胺更好；胸腺指數和脾指數結果表明，用藥組中荷瘤小鼠的胸腺指數和脾指數都比模型組的免疫指數略大一些，可能是接種腫瘤后刺激了免疫系統，也可能是吞噬作用或病理性增大。