糖尿病心肌PTEN蛋白表達變化及其在糖尿病心肌IPo中的影響

梁德賢　李慶軍　陳康榮

[摘要]目的：分析糖尿病心肌PTEN蛋白表達變化及其在糖尿病心肌IPo中的作用。方法：選取健康成年SD大鼠，腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ）（60mg/kg）誘導糖尿病模型。對照組給予等量的生理鹽水。將糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠隨機分為3組：假手術組（Sham）；缺血/再灌注組（IR）；缺血后處理組（IP0）。部分亞組糖尿病大鼠在缺血前1h用trFEN抑制劑BPV（HOpic）干預后再進行缺血/再灌注損傷實驗。免疫組化方法分析心肌PTEN、PI-3K、p-Akt的表達；TYC法檢測心肌梗死面積；TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。比較非糖尿病與糖尿病組及BPV干預前后糖尿病各組相應指標的變化。結果：IPo明顯降低了非糖尿病鼠心肌細胞中PTEN的表達，增加了H-3K和p-Akt的表達，但未能減少PTEN在糖尿病鼠心肌中的表達，相應的Pl-3K和p-Akt的表達也無明顯改變。與N+S組相比，N+IR及N+IPo組的凋亡指數增高（P<0.05）。但是經后處理干預后N+IPo組的凋亡指數低于N+IR組（P<0.05）。與DM+S組相比，DM+IR及DM+IPo組的凋亡指數增高（P<0.05），但后處理并沒有減少糖尿病心肌的凋亡指數。與N+IR相比，N+IPo的梗死面積減少（P<0.05）。然而，DM+IR組與DM+IPo組的梗死面積無統計學差異（P>0.06）。BPV干預各組的心肌PI-3K及P-Akt的表達高于未干預各組（P<0.05）。與未經BPV干預的各組相比，被干預各組的心肌凋亡細胞減少。心肌梗死面積比較BPV干預的各組心肌梗死減少。結論：高血糖導致心肌PTEN高表達使PI-3K/Akt信號通路失活，是導致IPo對心肌IRI保護作用喪失的一個重要原因。

[關鍵詞]糖尿病；缺血再灌注損傷；缺血后處理；PTEN；BPV

有研究發現PTEN（Phosohatase and tensin honologdeleted on chromosometen，PTEN）是PI-3K/Akt信號通路的負性調控因子。它起初被發現是一種腫瘤抑制基因。后來越來越多的研究發現它在調節細胞增殖、生長和凋亡中也起到重要作用。有研究顯示，與非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠體內PTEN的表達明顯增多，并會隨著病程的延長增加其表達的程度。增加PTEN的活性會使胰島素的敏感性下降，并且會增加2型糖尿病的風險。Mensah等人實驗證明，通過阿托伐他汀進行IPC，可通過激活PT-3K/Akt信號通路，對非糖尿病大鼠心肌IRI產生保護作用，但對糖尿病大鼠心肌IRI的療效顯著降低，其主要原因是由于PTEN的拮抗作用。Crackower等人通過對mN半量表達的PTEN+/-小鼠離體心臟的研究表明，在P1EN+/-的小鼠體內，Akt的活性明顯增加，經4周期的預處理PTEN+/-組的心肌梗死面積明顯小于6周期預處理的PTEN+/+對照組。因此可以看出P1EN在糖尿病心肌IRI中也扮演著重要的角色。然而關于PTEN在缺血后處理（Ischemic postconditioning，IPo）的作用機制中發揮著怎樣的作用，以及IPo對糖尿病心肌IRI保護作用的消失是否與糖尿病心肌中PTEN高表達有關，現在還不十分清楚。因此，本研究擬探討糖尿病心肌PTEN蛋白表達變化及其在糖尿病心肌IPo中的作用。對比IPo對糖尿病和非糖尿病心肌PTEN/PI-3K/Akt信號通路的影響情況，及其對心肌IRI的改善情況；觀察抑制PTEN的表達是否能改善糖尿病心肌的損傷程度；證明糖尿病心肌PTEN的高表達是導致心肌IRI耐受力降低和IPo保護作用消失的重要原因。

1.材料與方法

1.1材料 實驗動物：220～280g成年SD大鼠130只，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。主要試劑及儀器：SureStep血糖儀、血糖試紙（美國強生公司）；Bene View T5型監護儀（西安巨田醫療設備有限公司）；DW-2000型動物呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司）；高精度電子天平（精度0.0001g，上海越平科學儀器有限公司）；SHHW21Gr600恒溫水浴箱（北京長安科學儀器廠）；Olympus顯微鏡（日本Olympus公司）；Olympus BXS0顯微攝影系統（日本Olympus公司）；EPSON-V30掃描儀（日本Epson公司）；ImageProPlus6.0計算機圖像分析軟件（美國Media Cyberneties）；鏈脲佐菌素（Streptozoein，STZ），美國Sigma公司；戊巴比妥鈉（Pentobarbital），美國Sigma公司；伊文氏藍（Evans blue），美國Sigma公司；三苯基氯化四氮唑（TTC），美國Sigma公司；Bpv（HOpic），瑞士Alexis公司；PTEN單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；P13K（P85cL亞型）單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；P-Akt（ser-473）單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物制品有限公司；TUNEL試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2方法 糖尿病大鼠及非糖尿病大鼠模型的建立：220～280g成年SD大鼠130只，喂養一周后，隨機分為糖尿病組（n=90）和非糖尿病組（n=40），所有大鼠禁食12小時。腹腔注射1%STZ60mg/kg誘導糖尿病模型，非糖尿病組的大鼠腹腔注射等量的生理鹽水，其余操作同糖尿病組大鼠。72h后禁食4h，斷尾取血測空腹血糖。當血糖濃度≥16.7mmol/L，并且出現多飲、多食、多尿的癥狀表示糖尿病鼠模型誘導成功。模型成功后監測大鼠血糖和體重，每2周一次。所有大鼠普食喂養8周。8周后進行手術。淘汰標準：①血糖濃度<16.7mmol/L的大鼠，②飼養過程中死亡的大鼠。

實驗分組：造模成功的糖尿病和非糖尿病大鼠隨機分為9組，實驗過程中剔除造模未成功和手術過程中死亡的模型，具體實驗分組如下：非糖尿病+假手術組（N+s組）：n=9；糖尿病+假手術組（DM+S組）：n=9；非糖尿病+缺血再灌注組（N+IR組）：n=15；糖尿病+缺血再灌注組（DM+IR組）：n=15；非糖尿病+缺血后處理組（N+IPo組）：n=15；糖尿病+缺血后處理組（DM+IPo組）：n=15；糖尿病+假手術組+抑制劑組（B+DM+S組）：n=9；糖尿病+缺血再灌注+抑制劑組（B+DM+IR組）：n=15；糖尿病+缺血后處理+抑制劑組（B+DM+IPo組）：n=15。以上標有“*”的各組中6個心臟標本用于TFC，另外9個和非“*”的各組標本全部用于組織包埋。