微藻去除水中低濃度硝態(tài)氮的研究

楊淼+施宇震+施永生+王琳+胡檸檬

摘要：利用微藻去除水中低濃度硝態(tài)氮，無(wú)需供應(yīng)氧氣、不產(chǎn)生二氧化碳且微藻的生物體尚可有利用價(jià)值。研究篩選了3種微藻（[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、鹽藻（Dunaliella sp.））進(jìn)行水中低濃度硝態(tài)氮去除率實(shí)驗(yàn)，證明了3種微藻均對(duì)水中硝態(tài)氮有較好的適應(yīng)性和去除效果。其中，對(duì)NO2-的去除率均大于對(duì)NO3-的去除率。淡水藻比鹽藻對(duì)水中硝態(tài)氮的去除率要高。

Abstract： To remove the low concentration nitrate in water by microalgae， there is no need of oxygen supply， no carbon dioxide produced， and the microalgae organisms still can be useful. Three microalgae， including Scenedesmus obliquus， Chlorella vulgaris and Dunaliella sp. are screened for the experiment of removing low concentration nitrate in water. It was proved that the three microalgae had great adaptability and removal effect on nitrate nitrogen in water. The removal rate of NO2- was higher than that of NO3-. The removal rate of NO3+ of fresh algae is higher than that of Dunaliella salina

關(guān)鍵詞：微藻；硝態(tài)氮；藻類篩選；去除效果

Key words： microalgae；nitrate nitrogen；algae screening；removal effect

中圖分類號(hào)：X703 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-4311（2017）15-0196-05

0 引言

水污染防治中硝態(tài)氮是非常重要的控制物[1]。硝態(tài)氮在水中主要以NO2-及NO3-形式存在[2、3]。微生物脫氮是目前經(jīng)濟(jì)、有效及應(yīng)用最廣泛去除水中氨氮及硝態(tài)氮的方法[4、5、6]。但是，微生物脫氮需要?jiǎng)恿ο蛩刑峁┏渥愕难鯕鈁7、8]，微生物脫氮過(guò)程中產(chǎn)生大量的二氧化碳，處理后生物殘?bào)w的處置也是難題[9、10]，處理后的再生水用來(lái)灌溉土地，會(huì)使硝態(tài)氮在土壤里殘留、積累并對(duì)地下水造成一定的污染[11]。若進(jìn)一步篩選微生物，利用微藻去除水中硝態(tài)氮，則微藻的易得、生長(zhǎng)速率快、占用空間少、光合效率高等獨(dú)有特點(diǎn)使硝態(tài)氮得到去除的同時(shí)，可產(chǎn)生大量氧氣并實(shí)現(xiàn)生物固碳、固氮，避免傳統(tǒng)生物處理中供氧消耗動(dòng)力、產(chǎn)生大量二氧化碳的問(wèn)題。精純的微藻生物質(zhì)還有較好的商業(yè)價(jià)值，會(huì)使水中硝態(tài)氮去除處理過(guò)程低碳、環(huán)保及資源化。由此可見(jiàn)，此項(xiàng)研究是十分有意義的。

據(jù)報(bào)道，杜氏鹽藻Dunaliella tertiolecta可以直接利用水中的NO2-及NO3-為氮源[12]。李濤等[13]通過(guò)對(duì)20株淡水和海洋微藻的研究，發(fā)現(xiàn)柵藻Scenedesmus sp.是最具產(chǎn)業(yè)化潛力的微藻，其總脂收獲量和單位體積總脂產(chǎn)率分別為3.5g/L和218.7mg/L.d，并且對(duì)亞硝酸鹽的吸收有明顯的效果。李天培等[14]對(duì)15種小球藻菌株進(jìn)行水中高濃度亞硝酸鹽（HN，176.5mmol/L）耐受程度的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)小球藻Chlorella sp.菌株能維持穩(wěn)定的增長(zhǎng)率且細(xì)胞內(nèi)TAG積累量比其他實(shí)驗(yàn)菌株多2倍。小球藻Chlorella sp.對(duì)亞硝酸鹽的去除率為60%[15]。

本文主要對(duì)12種富油脂微藻（淡水藻9種，鹽水藻3種）進(jìn)行篩選、馴化，對(duì)2種野生雜藻進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)，并分析研究了微海藻對(duì)水中NO2-及NO3-的適應(yīng)性及去除效果。

1 方法及內(nèi)容

1.1 藻類的篩選及培養(yǎng)

藻類的篩選主要目的是通過(guò)篩選過(guò)程，產(chǎn)生一個(gè)生產(chǎn)富含營(yíng)養(yǎng)素成分高的目標(biāo)生物產(chǎn)品的菌株，或者能去除非目標(biāo)產(chǎn)物及營(yíng)養(yǎng)物的菌株。查閱文獻(xiàn)資料得知各種藻類的生長(zhǎng)環(huán)境、自身生物素含量及對(duì)水中NO2-及NO3-的去除率等因素的基礎(chǔ)上，確定實(shí)驗(yàn)研究藻種，表1是初步篩選出的15種富油脂藻類的營(yíng)養(yǎng)成分組成。通過(guò)對(duì)比15種微藻生長(zhǎng)周期、生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)環(huán)境及藻類的營(yíng)養(yǎng)成分組成，最為有利的研究對(duì)象為小球藻、柵藻、微綠球藻、衣藻和鹽藻、螺旋藻等12種微藻為研究對(duì)象。

微藻來(lái)源：[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomasreinhardtii）來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所（Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences）；螺旋藻（Spirula）、螺旋藻淡水（Spirula）、小球藻淡水（Chlorella sp.）、微綠球藻（Nannochloropsisoculta）、微綠球藻淡水（Nannochloropsisoculata）、鹽藻（Dunaliella sp.）、小球藻F5（Chlorella sp.）來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院海洋生物研究所（Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences）；野生雜藻來(lái)源于昆明滇池（第一種來(lái)源于滇池草海、第二種來(lái)源于滇池排污入口）。

培養(yǎng)基：BG11培養(yǎng)基、SE培養(yǎng)基、f/2培養(yǎng)基。

微藻培養(yǎng)：[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomas reinhardtii）使用SE培養(yǎng)基培養(yǎng)，螺旋藻（Spirula）、微綠球藻（Nannochloropsisoculata）、鹽藻（Dunalilla sp.）使用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余全部使用BG11培養(yǎng)。每種藻培養(yǎng)時(shí)以1：20（藻液5ml：培養(yǎng)基100ml）接種到玻璃三角瓶中，每日定時(shí)搖動(dòng)三角瓶2次，培養(yǎng)溫度25℃，光照條件2000Lux，培養(yǎng)基pH值6.8-8.0。培養(yǎng)7天，使微藻的吸光度在0.5Abs以上。

1.2 硝態(tài)氮的濃度及投加

根據(jù)再生水、地表水及地下水等多類水體的硝態(tài)氮濃度調(diào)查，水體中總氮含量為18.6mg/L，其中80.6%的存在形式是硝態(tài)氮[16]。研究設(shè)計(jì)，投加硝態(tài)氮的總含量為15 mg/L，其中亞硝態(tài)氮含量占90%，硝態(tài)氮含量占10%。濃度梯度分配見(jiàn)表2。

微藻的培養(yǎng)和篩選研究，將培養(yǎng)基和微藻溶液以20：1的比例，即培養(yǎng)基100mL，微藻溶液5mL接種在250mL錐形瓶中，培養(yǎng)7天，使微藻的吸光度在0.5Abs以上，連續(xù)加21天污染物。在100mL微藻培養(yǎng)液中投加0.0148mol/L硝酸鈉和0.25mol/L亞硝酸鈉溶液，兩種溶液的每日投加量見(jiàn)表3。

微藻在培養(yǎng)篩選的過(guò)程中，每天在加污染物前用紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)600納米）測(cè)定每種微藻的吸光度，換算成微藻的顆粒密度，計(jì)算其生長(zhǎng)速率，確定對(duì)硝態(tài)氮抗性強(qiáng)、生長(zhǎng)率高的微藻。

1.3 研究過(guò)程

由上選出三種微藻[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、鹽藻（Dunaliella sp.）作研究。

將培養(yǎng)基中用作氮源的NaNO3分5個(gè)濃度梯度，具體濃度見(jiàn)表4、表5。

用離子色譜法測(cè)定NO2-、NO3-去除率：取第一批篩選試驗(yàn)中培養(yǎng)21天第4濃度梯度的微藻[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、鹽藻（Dunaliella sp.），分別接種在表4、表5的5種濃度梯度相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后每天加入表3中NaNO3和NaNO2第4濃度梯度相應(yīng)的量，持續(xù)加入21天，每天用離子色譜儀測(cè)定溶液中NO3-、NO2-的量，計(jì)算其去除率。

2 研究結(jié)果及分析

2.1 藻類篩選數(shù)據(jù)分析

對(duì)于微藻生長(zhǎng)過(guò)程中的每日檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，溶液中溶解氧高達(dá)20.7mg/L，長(zhǎng)勢(shì)良好的微藻的pH值范圍為8.5-10.92。微藻的生物質(zhì)濃度（每升干重）計(jì)算方法參考[17]建立的光密度與細(xì)胞干重間的關(guān)系如下：

根據(jù)7天對(duì)微藻的復(fù)活培養(yǎng)，螺旋藻、淡水螺旋藻及小球藻（鹽水）都沒(méi)能成功復(fù)活，所以最后培養(yǎng)12種微藻，根據(jù)12種海藻21天加入表3中硝酸鈉和亞硝酸鈉的量比較12種藻的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)6種有代表性微藻生長(zhǎng)曲線圖1～4。

根據(jù)12種微藻21天培養(yǎng)生長(zhǎng)趨勢(shì)曲線對(duì)比，發(fā)現(xiàn)[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、小球藻淡水（Chlorella sp.）、鹽藻（Dunaliella sp.）這6種微藻在每種濃度梯度加入量情況下生長(zhǎng)趨勢(shì)良好；[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomasreinhardtii）、微綠球藻（Nannochloropsisoculata）、微綠球藻淡水（Nannochloropsisoculata）在第1、2、3濃度梯度加入量情況下生長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，第4濃度梯度及第5濃度梯度生長(zhǎng)到一星期左右呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomasreinhardtii）生長(zhǎng)過(guò)程中附壁現(xiàn)象比較嚴(yán)重，除此之外，其生物細(xì)胞會(huì)結(jié)成大量的團(tuán)塊狀物質(zhì)，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最終的準(zhǔn)確度；小球藻F5（Chlorella sp.）在第1、2、3、4濃度梯度情況下生長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，在第5濃度梯度投加量情況下生長(zhǎng)一星期后生長(zhǎng)趨勢(shì)呈下降狀態(tài)；滇池排污溝取樣的雜藻的生長(zhǎng)在5種濃度梯度下都呈上升趨勢(shì)，滇池草海中的野生雜藻沒(méi)有固定的生長(zhǎng)趨勢(shì)規(guī)律。由此可見(jiàn)我們對(duì)比第5濃度梯度下各種微藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)曲線就可以篩選出在水中硝態(tài)氮濃度為15mg/L下能正常存活的微藻，見(jiàn)圖5。

如圖5所示，能在第5濃度梯度硝酸鈉和亞硝酸鈉投加量的情況下依然呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)的微藻有[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、小球藻（Chlorella sp.）、鹽藻（Dunaliella sp.）。通過(guò)分析以上6種生長(zhǎng)趨勢(shì)良好微藻的平均生長(zhǎng)速率圖6，確定此研究篩選的最適微藻。

由圖6可知，在加入第5濃度梯度氮氧化物量的21天連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、小球藻（Chlorella sp.）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、鹽藻（Dunaliella sp.）的平均生長(zhǎng)速率是由大到小的關(guān)系。其中前4種都是相同的種類的小球藻系列微藻，由此可見(jiàn)，小球藻種在去除水中硝態(tài)氮的方向具有無(wú)限潛力。

2.2 硝態(tài)氮去除數(shù)據(jù)分析

通過(guò)篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有6種微藻在添加硝態(tài)氮達(dá)20mg/L的濃度后仍然能生長(zhǎng)良好，證明這6種微藻在加入高濃度硝態(tài)氮時(shí)能較好存活。

在微藻對(duì)硝態(tài)氮去除實(shí)驗(yàn)中，每天加入NO3-、NO2-，通過(guò)離子色譜法測(cè)定每天溶液中NO3-、NO2-的濃度，計(jì)算微藻對(duì)硝態(tài)氮的吸收率。

選擇的[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、鹽藻（Dunaliella sp.）3種微藻，連續(xù)21天使用離子色譜儀測(cè)定NO3-、NO2-含量，計(jì)算每天微藻吸收NO3-、NO2-的量。三種微藻21天平均生長(zhǎng)率圖7～9發(fā)現(xiàn)，普通小球藻、柵藻兩種淡水微藻培養(yǎng)基中無(wú)氮源的情況下，加入的硝態(tài)氮污染物的微藻比沒(méi)有加入硝態(tài)氮微藻生長(zhǎng)速率快。但是，對(duì)于鹽藻來(lái)說(shuō)加入硝態(tài)氮的微藻平均生長(zhǎng)率低于不加硝態(tài)氮的微藻。

3種微藻對(duì)硝態(tài)氮的平均每日去除率，見(jiàn)表6。每種微藻對(duì)于NO2-的去除率大于NO3-的去除率。普通小球藻在第4濃度梯度（即NaNO3含量1.2g/L）培養(yǎng)基中對(duì)NO2-的去除率最高，為72.86%，在沒(méi)有氮源的培養(yǎng)基中（即NaNO3含量0g/L）對(duì)NO3-去除率最高為28.93%。柵藻在第3濃度梯度培養(yǎng)基（即NaNO3含量0.75g/L）中對(duì)于NO2-的去除率最高，為85.66%，在第5濃度梯度（即NaNO3含量1.5g/L）培養(yǎng)基中對(duì)于NO3-去除率最高，為62.66%。對(duì)于鹽藻，其吸收效果遠(yuǎn)沒(méi)有兩種淡水藻吸收效果好，在沒(méi)有氮源的培養(yǎng)基中（即NaNO3含量0g/L）對(duì)NO2-的去除率最高，為17.46%，在第4濃度梯度（即NaNO3含量1.5g/L）對(duì)NO3-的吸收率最高為1.64%。

3 結(jié)論

①微藻生物能夠在硝態(tài)氮濃度較高的水中存活（高達(dá)20mg/L），并且將水中的氨氮作為微藻生存所需要的氮源。

②微藻生物對(duì)水中的NO2-的去除率高達(dá)為85.666%，對(duì)NO3-去除率高達(dá)62.66%；微藻對(duì)硝態(tài)氮的吸收中，NO2-的去除率大于NO3-去除率。淡水藻對(duì)硝態(tài)氮吸收效果遠(yuǎn)比鹽藻好。

③微藻脫氮同時(shí)產(chǎn)生氧氣并吸收二氧化碳，避免傳統(tǒng)生物處理中供養(yǎng)耗動(dòng)力、產(chǎn)生大量的二氧化碳，精純的微藻生物質(zhì)還有較好的商業(yè)價(jià)值。小球藻、柵藻、鹽藻因其代謝形成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富且具有降血脂、血壓、增阿強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤、解毒等功效，是很好的保健品。

④微藻對(duì)硝態(tài)氮去除處理過(guò)程低碳、環(huán)保及易資源化，將此方法推廣到去除水中其他污染物也會(huì)有很大的前景。

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