一例仔豬致病性大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

祖立闖，謝金文，姚春陽，孟 霞，齊繼紅，趙家磊，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

一例仔豬致病性大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

祖立闖1，謝金文2，姚春陽2，孟 霞1，齊繼紅1，趙家磊1，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

為確定仔豬的死亡原因并為豬場及時制定防控措施提供參考依據(jù)，對病料樣品進行鏡檢觀察、細菌分離培養(yǎng)與純化、分離菌株的形態(tài)特征觀察、生化試驗、致病性試驗、16S rRNA序列鑒定等，最終鑒定為仔豬致病性大腸桿菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株在13種常見藥物中對環(huán)丙沙星、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢噻肟、阿莫西林、氟苯尼考8種藥物高度敏感，對紅霉素、阿米卡星、慶大霉素3種藥物中度敏感，對強力霉素、四環(huán)素2種藥物低度敏感。

仔豬；大腸桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

豬大腸桿菌病是由致病性大腸埃希氏菌的某些血清型及其毒素引起的一種腸道傳染性疾病，主要危害仔豬，可引起仔豬生長發(fā)育遲緩，生產(chǎn)性能低下，甚至造成死亡，是目前危害仔豬生長發(fā)育的主要疫病之一，每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失[1-2]。該病的流行無明顯季節(jié)性，但一般在過于潮濕炎熱的夏季和極其寒冷的冬季易發(fā)生，而在溫暖的春季和秋季較少發(fā)生[3]。2016年8月，連續(xù)多日降雨過后，山東省濱州市某豬場飼養(yǎng)的2～3月齡仔豬發(fā)病，表現(xiàn)為呼吸困難，厭食，精神萎靡，體溫升高，肝臟和腎臟壞死、有出血點，根據(jù)臨床癥狀和剖檢病理變化初步診斷為疑似大腸桿菌感染。為進一步確診，本研究進行了病料樣品的鏡檢觀察、細菌的分離與鑒定等實驗室診斷，并對分離菌株進行了藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 臨床病料樣品的采集

對病死豬進行解剖，無菌采集病死豬的肝臟、腎臟、脾臟等病變組織，低溫條件運往實驗室。

1.2 實驗室檢測時間與地點

實驗室檢測于2016年8月26日至2017年1月18日在山東省濱州市預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點開放實驗室進行。

1.3 培養(yǎng)基、試劑、試劑盒、試驗動物

麥康凱瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯購自北京中海生物科技有限公司；細菌生化反應(yīng)管購于杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司；Taq酶、dNTP、DL 2 000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；健康昆明系小白鼠購自山東省實驗動物中心。

1.4 病料樣品的鏡檢觀察

將采集的病料樣品涂片，革蘭氏染色，鏡檢觀察是否存在可疑細菌。

1.5 細菌分離培養(yǎng)與純化

將采集的病料樣品分別接種于麥康凱瓊脂平板和營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)至24 h，觀察菌落特征。挑取單菌落連續(xù)傳代純化至菌落大小與形態(tài)均一。

1.6 分離菌株的形態(tài)特征觀察

取純化后單菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)特征。

1.7 分離菌株的生化試驗

取分離菌株分別接種至各種生化鑒定管，按常規(guī)方法測定分離菌株的生化特性。

1.8 分離菌株致病性試驗

取營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)的分離菌株腹腔接種20～22 g健康昆明系小白鼠10只，0.2 mL/只，同時取10只小白鼠接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為對照，隔離飼養(yǎng)，觀察至攻毒后7 d。

1.9 分離菌株16S rRNA序列鑒定

設(shè)計合成1對細菌16S rRNA基因通用型檢測引物（上游引物序列：5′-TCAGATTGAACGCTGGCG G-3′；下游引物序列：5′-CACCCCAGTCATGAATCAT -3′）。參照細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明提取分離菌株的基因組DNA。利用細菌16S rRNA基因通用型檢測引物對分離菌株基因組DNA進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1.0 μL、Taq酶1 μL、DNA 5 μL、補水至50 μL。PCR擴增程序：95℃5 min；95℃1 min，55℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結(jié)果與GenBank中登錄的細菌基因組16S rRNA序列進行比對分析。

1.10 藥敏試驗

利用K-B涂布法測定分離菌株對環(huán)丙沙星等13種常見藥物的敏感性，當抑菌環(huán)直徑在15 mm以上判斷為高度敏感，10～15 mm判斷為中度敏感，10 mm以下判斷為低度敏感，無抑菌環(huán)判斷為耐藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料樣品鏡檢結(jié)果

如圖1所示，將采集的病料樣品涂片，革蘭氏染色，鏡檢可見革蘭氏陰性菌小桿菌，單個或多數(shù)散在排列，無芽孢。

圖1 臨床病料樣品革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 細菌分離培養(yǎng)與純化結(jié)果

營養(yǎng)瓊脂平板生長出圓形、光滑、半透明、隆起的灰白色菌落，麥康凱瓊脂平板上長出圓形、光滑、邊緣整齊、隆起的粉紅色菌落。經(jīng)連續(xù)傳代純化后，菌落大小均一，均呈圓形、光滑、邊緣整齊、隆起。

2.3 分離菌株形態(tài)特征觀察結(jié)果

如圖2所示，純化后單菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢可見革蘭氏陰性小桿菌。

圖2 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.4 分離菌株生化鑒定結(jié)果

如表1所示，分離菌株符合大腸桿菌的生化特性。

表1 分離菌株的生化特性

2.5 分離菌株致病性試驗結(jié)果

接種分離菌株的10只小白鼠在接種后2 h開始出現(xiàn)精神萎靡、厭食等癥狀，至接種后8 h 10只小白鼠已全部死亡。而對照組10只小白鼠均健活，精神與食欲均正常，未見任何不良反應(yīng)。表明分離菌株具有較強的致病性。

2.6 分離菌株16S rRNA序列鑒定結(jié)果

如圖3所示，分離菌株經(jīng)16S rRNA通用型引物擴增后，在大小約為1 500 bp處具有特異性擴增條帶，與試驗預(yù)期結(jié)果相符。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)序列測定表明為大腸桿菌16S rRNA基因特異性序列。

圖3 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果

2.7 藥敏試驗結(jié)果

如表2所示，分離菌株對環(huán)丙沙星等13種常見藥物表現(xiàn)出了不同程度的敏感性，其中高敏藥物8種，分別為環(huán)丙沙星、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢噻肟、阿莫西林、氟苯尼考；中敏藥物3種，分別為紅霉素、阿米卡星、慶大霉素；低敏藥物2種，分別為強力霉素、四環(huán)素；無耐藥藥物；即分離菌株的高敏和中敏藥物共計11種，分離菌株藥物敏感率為84.62%（11/13）。雖然有2種藥物為低敏藥物，但未篩選出耐藥性藥物，分離菌株耐藥性相對不嚴重。

表2 分離菌株對13種藥物的敏感性

3 討論

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模化快速發(fā)展，仔豬大腸桿菌的發(fā)生與流行有明顯增加的趨勢[4]。因大腸桿菌為條件性致病菌，外界環(huán)境潮濕、寒冷、擁擠、飼料霉變等因素均易誘發(fā)本病，故對該病應(yīng)采取預(yù)防為主的綜合防控措施。在豬的日常飼養(yǎng)管理中應(yīng)避受潮、受熱、受寒、擁擠、刺激等，改善養(yǎng)殖環(huán)境，保持通風(fēng)，定期消毒，搞好養(yǎng)殖衛(wèi)生，嚴禁飼喂霉變飼料。由于大腸桿菌具有多種血清型，抗原比較復(fù)雜，且變異性較強，給使用疫苗防治該病增加了難度。在疫苗的選擇上，養(yǎng)殖單位應(yīng)結(jié)合當?shù)亟陙砹餍械膬?yōu)勢血清型，選擇與優(yōu)勢血清型一致的疫苗或多價聯(lián)苗。目前，我國獸醫(yī)臨床中常使用抗菌藥物進行細菌性疫病進行預(yù)防與治療，而抗菌藥物長期大量濫用必然導(dǎo)致耐藥性的不斷增強。我國研究學(xué)者對規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌的耐藥性檢測結(jié)果表明，我國部分地區(qū)豬大腸桿菌的耐藥情況已非常嚴重[5-6]。本研究中的大腸桿菌分離菌株在13種常見藥物中對環(huán)丙沙星等11種藥物呈現(xiàn)出高度敏感或中度敏感，藥物敏感率達84.62%（11/13），分離菌株耐藥性相對不嚴重，這與該豬場平時不濫用抗菌藥物密切相關(guān)。豬場應(yīng)定期對當?shù)氐呢i大腸桿菌病流行菌株進行血清型和耐藥性監(jiān)測，篩選出與之匹配的疫苗和敏感的治療藥物，避免抗菌藥物的大量濫用，同時采用交叉用藥或輪換用藥的用藥方式，在降低該病臨床發(fā)病率的同時，降低耐藥菌株的產(chǎn)生，保障動物源食品安全。

[1]姚淑紅.豬大腸桿菌病及其流行特點[J].山東畜牧獸醫(yī)，2016，37（6）：32.

[2] 譚婭，史開志，王婧，等.豬大腸桿菌病防治的研究進展[J].中國畜禽種業(yè)，2016（9）：127-129.

[3] 李占霞.豬大腸桿菌病的發(fā)病原因、臨床癥狀和防控[J].現(xiàn)代畜牧科技，2016（9）：162.

[4] 桑友軍.養(yǎng)豬場豬大腸桿菌的流行情況調(diào)查分析[J].當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2016（12）：4-5.

[5] 曹敏，譚艾娟，呂世明，等.貴州部分地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性分析及ESBLs基因型檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（4）：1098-1104.

[6] 顏友榮，方向紅，王琳琳.蘇中地區(qū)豬大腸桿菌的耐藥性與耐藥基因的試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2016，52（2）：90-92.

（編輯：富春妮）

世衛(wèi)呼吁嚴密監(jiān)控禽流感

【路透社日內(nèi)瓦1月23日電】世界衛(wèi)生組織呼吁各國嚴密監(jiān)控致命的禽流感疫情，及時報告可能預(yù)示著流感大流行的人類感染禽流感病例。

自去年底以來，不同菌株的禽流感在歐洲和亞洲傳播，導(dǎo)致某些國家大規(guī)模滅殺家禽，中國出現(xiàn)了致人死亡的病例。

據(jù)世衛(wèi)組織稱，自去年11月以來，近40個國家報告了家禽或野生鳥類出現(xiàn)的高致病禽流感新疫情。

世衛(wèi)組織總干事陳馮富珍在這個聯(lián)合國機構(gòu)為期10天的執(zhí)行委員會會議開幕時說：“這些疫情迅速擴大的地理分布和當前同時傳播的病毒菌株數(shù)量讓世衛(wèi)組織高度警惕。”

她說，在亞洲造成嚴重疫情的H5N6新菌株是由4種不同病毒之間進行基因交換而成的。

陳馮富珍說，繼2009—2010年H1N1禽流感疫情在世界傳播之后，全世界現(xiàn)在應(yīng)對下一次流感疫情的準備工作做得更好了，“不過這還不夠”。

她說，自去年12月以來，中國感染H7N9病例“突然大增”，而世衛(wèi)組織尚未排除兩組人感染禽流感病例中存在有限的人傳人的情況，雖然到目前為止，沒有發(fā)現(xiàn)持續(xù)的傳染。

她說，根據(jù)國際衛(wèi)生條例，世衛(wèi)組織194個成員國必須及時發(fā)現(xiàn)和報告感染病例。她補充說：“我們無法承擔錯過早期信息的后果。”

國家衛(wèi)計委官員張揚率領(lǐng)的中國代表團在日內(nèi)瓦會議上表示，中國在疫情的通報和應(yīng)對方面將履行自己的義務(wù)。張揚說：“目前H7N9病例的統(tǒng)計總數(shù)沒有變化。中國將繼續(xù)在這方面加強與世衛(wèi)組織的合作與交流。”

【德新社德國基爾1月23日電】題：德國北部發(fā)現(xiàn)新型禽流感

德國農(nóng)業(yè)部門周一表示，在德國北部的石勒蘇益格-荷爾斯泰因州的家禽身上發(fā)現(xiàn)了一種新型禽流感。

該州農(nóng)業(yè)部長羅伯特·哈貝克說：“這一發(fā)現(xiàn)表明禽流感是多么活躍，該病毒仍然存在且正在變異。”

這種新類型的禽流感病毒被歸類為H5N5亞型。

州農(nóng)業(yè)部稱，發(fā)現(xiàn)這一禽流感的弗里德里希·洛夫勒研究所科研人員表示，這種新亞型的治療與H5N8禽流感的現(xiàn)有治療相同。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2017-01-25）

S858.28

A

1002-1957(2017)02-0100-03

2017-02-22

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-08-17）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:zulichuang2008@126.com