云南豬群中豬捷申病毒感染分子生物學(xué)診斷

趙國(guó)洪，嚴(yán) 歡，韓建強(qiáng)，趙 津，鄒豐才，信愛(ài)國(guó)

（1．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653106；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

云南豬群中豬捷申病毒感染分子生物學(xué)診斷

趙國(guó)洪1，2，嚴(yán) 歡1，3，韓建強(qiáng)2，趙 津2，鄒豐才3，信愛(ài)國(guó)1

（1．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653106；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

豬捷申病是由豬捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）感染引起的豬的一種病毒性傳染病。文章根據(jù)GenBank收錄的PTV基因序列設(shè)計(jì)套式引物，建立檢測(cè)PTV的套式RT-PCR診斷方法；從云南省某豬場(chǎng)疑似豬捷申病的病料中檢測(cè)出PTV核酸陽(yáng)性，產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序，與GenBank收錄的PTV毒株序列比對(duì)，結(jié)果表明該擴(kuò)增序列與PTV同源性為99%～95%，首次在云南確診了PTV感染存在。

豬捷申病毒（PTV）；RT-PCR；分子診斷

豬捷申病毒（Porcine teschovirus,PTV）可引起豬傳染性腦脊髓灰質(zhì)炎、下痢、心肌炎、心包炎、肺炎、繁殖障礙和皮膚損傷或者無(wú)臨床癥狀等多種臨床表現(xiàn)的豬捷申病。該病的發(fā)病率可達(dá)50%，致死率達(dá)70%～90%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。PTV原歸屬于豬腸道病毒（Porcine enterovirus,PEV）Ⅰ類(lèi)群，在分子結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化中與PEV其他2類(lèi)群血清型毒株相異，有著獨(dú)特的特征，因此，目前已將豬腸道病毒的類(lèi)群Ⅰ各血清型單獨(dú)歸為豬捷申病毒屬。目前已報(bào)道的PTV有11種不同血清型[1]。目前捷申病毒已遍布亞洲，國(guó)內(nèi)2003年首次從內(nèi)蒙古地區(qū)某豬場(chǎng)分離得到第1株豬捷申病毒[2]，隨后在我國(guó)大部分豬場(chǎng)均有PTV分離報(bào)道[3-7]，而且PTV常伴隨著豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染[8]和與豬圓環(huán)病毒2型混合感染[9]，這說(shuō)明PTV在我國(guó)豬場(chǎng)中呈現(xiàn)混合感染的趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。省內(nèi)最早2003年在云南蘭坪[10]和2007年在云南馬龍[11]有對(duì)疑似該病的臨床診治報(bào)告，但都沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室確診報(bào)告。自2013年以來(lái)，云南多地豬場(chǎng)出現(xiàn)仔豬死亡、腹瀉，以腸炎、腦脊髓灰質(zhì)炎、心肌炎、心包炎、肺炎為主，伴隨繁殖障礙為主要臨床癥狀疫病。經(jīng)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室診斷，排除了豬的主要幾種疫病病原，最后采用分子診斷技術(shù)確診為PTV感染所致。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品處理

樣品采自2013年9月，云南某地規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)，發(fā)病豬群主要為斷奶仔豬，取樣時(shí)該豬場(chǎng)豬群中有豬只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，主要表現(xiàn)為后肢麻痹，呈犬坐姿勢(shì)，呼吸困難，并伴有腹瀉；豬只對(duì)刺激敏感，稍微刺激就尖叫。對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行放血，采集腦、心臟、肝臟、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、小腸等組織進(jìn)行送檢。對(duì)采集到的病豬組織樣品進(jìn)行研磨處理，按每克樣品加3 mL滅菌PBS充分研磨，制備成組織懸液。把組織懸液置于-80℃凍存20 min后取出溶解，重復(fù)3次。置于4℃條件下3 000 r/min離心20 min，取上清液置于低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

病毒總RNA提取試劑（RNAiso Plus）購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；cDNA合成試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super－Mix）、pEasy T1 Cloning Kit和 2×EasyPfu PCR SuperMix試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR膠回收試劑盒和DNA Marker DL 2 000購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PTV引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank收錄的PTV基因5′-非編碼區(qū)（5′-UTR）保守序列，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件分析，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立檢測(cè)PTV所有血清型的套式RT-PCR方法。引物序列見(jiàn)表1。引物由昆明碩擎生物有限公司合成。

表1 PTV套式RT-PCR引物

1.4 組織中核酸提取

按RNAiso Plus提取試劑的說(shuō)明書(shū)，提取病豬組織中總RNA。

1.5 PTV套式RT-PCR檢測(cè)

1.5.1 病毒cDNA的制備 按TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的制備。反應(yīng)體系（體系20 μL）組分如下：RNA 7.5 μL，PTV-1R 0.5 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，gDNA Removal 1.0 μL，Tran－Script RT/RI Enzye mix 1.0 μL。輕輕混勻，42℃30 min，85℃5 s，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 套式PCR反應(yīng) 第一輪PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)總體積為25 μL，cDNA 1 μL，PTV-1F/PTV-1R（10 μM）各0.5 μL，2×EasyPfu PCR SuperMix 12.5 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

第二輪PCR擴(kuò)增：首輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取該輪PCR產(chǎn)物1 μL作為模板，使用PTV-1nF和PTV-1nR各0.5 μL作為引物，其余反應(yīng)體系及條件與首輪相同。反應(yīng)結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。

1.5.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的分子克隆及序列比對(duì)分析 第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，使用膠回收試劑盒回收目的條帶，將其連接于pEasy T1載體中，轉(zhuǎn)化DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送昆明碩擎生物有限公司測(cè)序。所測(cè)序列采用VectorNTI 8.0軟件包中Contig Express整理拼接，之后提交GenBank進(jìn)行Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析。

1.6 其他幾種豬病的實(shí)驗(yàn)室診斷

對(duì)病料進(jìn)行豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬kuba病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（Rotavirus）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）檢測(cè)，按照云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)上述豬病檢測(cè)方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病臨床癥狀觀察及病理變化

據(jù)觀察統(tǒng)計(jì)，感染豬場(chǎng)中斷奶仔豬中發(fā)病率53.5%（45/84）。患病豬體溫升高，食欲廢絕，被毛粗亂，呼吸困難，嘔吐、腹瀉及行動(dòng)失調(diào)。1～2 d后，體溫降至正常后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，呈現(xiàn)四肢麻痹僵直（特別是后肢）和昏迷，病豬呈犬坐姿勢(shì)或于一側(cè)臥地，前肢作劃水樣，受聲響或觸摸刺激時(shí)，可引起四肢不協(xié)調(diào)的運(yùn)動(dòng)，或角弓反張，也可見(jiàn)面部麻痹和失音。部分病豬伴有腹瀉。

病理剖檢可見(jiàn)胸膜粘連，心臟表面附著灰白色纖維素性滲出物卻不易剝落，心肌壞死和漿液性纖維素性心包炎病變（圖1A和B）；肺部尖葉、心葉有灰色實(shí)變區(qū)（圖1C）；腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)腫大；腸黏膜充血、出血，腸壁變薄；也有患病豬觀察不到特征性的病變。

圖1 PTV患病豬病理剖檢

2.2 其他豬相關(guān)病原檢測(cè)結(jié)果

送檢病料對(duì)豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬kuba病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（Rotavirus）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）進(jìn)行了檢測(cè)，均為陰性結(jié)果，排除了上述這幾種病原的感染。

2.3 PTV套式RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

將疑似PTV的病料中各組織勻漿后提取病毒基因組RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以其為擴(kuò)增模板，用PTV特異性檢測(cè)引物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，樣品獲得與預(yù)期的158 bp條帶一致的特異性擴(kuò)增條帶，初步判定送檢的病料為PTV陽(yáng)性（圖2）。

圖2 PTV臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

2.4 PTV病料PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析結(jié)果

將上述第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化連接于pEasy T1載體中，挑陽(yáng)性克隆測(cè)序，采用VectorNTI 8.0軟件讀取數(shù)據(jù)，分析處理后，得到下列序列（圖3）。經(jīng)提交GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，提交比對(duì)序列與GenBank收錄的豬PTV序列同源性在99%～95%之間，其中與中國(guó)分離株（swine/CH/IMH/ 03）的同源性為98%，從病毒的進(jìn)化分類(lèi)結(jié)果顯示該核酸序列來(lái)源于PTV基因組（圖4）。結(jié)果表明送檢豬病料為PTV感染，將送檢病料命名為PTV/YN/ 2013。

圖3 PTV/YN/2013病原核酸檢測(cè)序列克隆測(cè)序結(jié)果

圖4 PTV/YN/2013核酸序列Blast比對(duì)結(jié)果

3 討論

豬捷申病在我國(guó)是一種新出現(xiàn)的豬只疫病，目前主要采用病毒分離鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)進(jìn)行診斷。在云南地區(qū)，雖然有兩例疑似病例報(bào)道[10-11]，都沒(méi)有進(jìn)行確診。本文采用RT-PCR擴(kuò)增PTV特異基因，結(jié)合核酸序列比對(duì)分析方法，首次對(duì)云南省豬群中對(duì)PTV感染引發(fā)的豬捷申病做出確診。證實(shí)云南省存在PTV感染，為我省的養(yǎng)豬疫病防控提供了科學(xué)依據(jù)。此外，PTV常和PRRSV、PCV2或其他一些容易引起豬產(chǎn)生神經(jīng)癥狀和以流產(chǎn)為主要癥候群的疫病引起相似臨床癥狀，我們對(duì)這些豬常見(jiàn)疫病進(jìn)行了鑒別診斷，排除了幾種病原感染的可能性，明確了該次疫病是由PTV感染所致。但是據(jù)報(bào)道，PTV目前在我國(guó)主要和PRRSV、PCV2混合感染，主要引起流產(chǎn)、仔豬死亡以及腹瀉、腸炎等[12]。因此，對(duì)PTV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷對(duì)該病的控制具有重要意義。

豬是捷申病毒的唯一宿主，不同年齡的豬都易感，仔豬的易感性較強(qiáng)。PTV血清型眾多，相互之間沒(méi)有交叉免疫性，在同一豬群中可有多個(gè)血清型，任何年齡的豬在感染某一血清型毒株后，可再感染其他血清型毒株。本次所檢測(cè)到的豬PTV具體屬于豬捷申病毒屬的哪個(gè)血清型還需進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行分離鑒定。此外，引起神經(jīng)癥狀、母豬繁殖障礙、腸炎、肺炎、心包炎和心肌炎等癥狀的疾病很多，PTV在云南地區(qū)流行的情況還不清楚，有必要進(jìn)一步對(duì)PTV開(kāi)展病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查。

應(yīng)對(duì)PTV的防控策略，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)豬捷申病尚無(wú)有效的治療方法，也無(wú)特效抗病毒藥物，只有采取綜合防制措施，才會(huì)有效降低發(fā)病率和死亡率。因此，建議豬場(chǎng)堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，盡量減少外購(gòu)豬的數(shù)量，嚴(yán)格控制外購(gòu)豬的質(zhì)量。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，特別要注意提高飼糧中能量飼料的供給，完善防寒保暖措施，提高豬群整體抗病能力。搞好豬舍的清潔衛(wèi)生和消毒工作。豬場(chǎng)一旦感染發(fā)病，除用抗菌藥物防止細(xì)菌繼發(fā)感染外，還要采取隔離措施，防止發(fā)病豬舍的病毒傳到健康舍。因該病毒在環(huán)境中廣泛存在，建議用發(fā)病豬的病料組織（如心、肝、脾、肺、腎或腦組織）分離病毒，如能從病料組織中分離到病毒，說(shuō)明豬場(chǎng)確實(shí)存在此病，可用從病料組織中分離出的病毒研制疫苗；如果僅在腸道里分離到病毒，有可能是帶毒[13]。也有建議采用后備種豬與隱性感染豬混養(yǎng)或接近混養(yǎng)，促使健康豬群產(chǎn)生抗體而達(dá)到預(yù)防的目的。但是，豬捷申病在我國(guó)尚未形成暴發(fā)流行，因此，搞好環(huán)境衛(wèi)生、做好保健工作，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理才是最重要防控措施。

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（編輯：郭玉翠）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)02-0113-03

2017-03-03

趙國(guó)洪（1984-），男，云南尋甸人，碩士，主要從事臨床獸醫(yī)教學(xué)及科研工作.E-mail：345994746@qq.com

信愛(ài)國(guó)（1974-），男，云南瀘西人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究工作.E-mail：kmvir@sina.com