壯藥壯通飲對(duì)大鼠內(nèi)源性腦神經(jīng)干細(xì)胞歸巢后神經(jīng)元功能的影響

陳曉鋒+吳世嫦+王婧婧+劉燕平+李凱風(fēng)+何乾超+劉強(qiáng)

【摘要】目的：觀察壯藥復(fù)方壯通飲對(duì)腦梗死模型大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞歸巢后神經(jīng)元功能的影響。方法：240只大鼠分為模型組、假手術(shù)組、壯通飲治療組、正常組，采用線栓法制作腦梗死模型，于術(shù)后1、3、7、14、21、28d這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批處死大鼠。用免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)BrdU、Nestin和梗死區(qū)域及相對(duì)應(yīng)區(qū)域的MBP、SYN的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果：模型組腦缺血區(qū)域相對(duì)應(yīng)區(qū)域MBP、SYN陽(yáng)性細(xì)胞大量表達(dá)，正常組和假手術(shù)組海馬區(qū)少量BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。模型組和壯通飲治療組BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多，MBP、SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少。壯通飲治療組BrdU、Nestin、MBP、SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量多于模型組，BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在第7天達(dá)到高峰，MBP、SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)于第14天達(dá)到高峰。結(jié)論：壯通飲可以促進(jìn)腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，并發(fā)揮正常的神經(jīng)功能。

【關(guān)鍵詞】壯通飲；內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞；NSC；歸巢；神經(jīng)元

【中圖分類號(hào)】R29【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）08-0029-06

腦梗死是臨床上常見(jiàn)的缺血性腦血管疾病，隨著中國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，腦梗死發(fā)病率和致殘率呈增高態(tài)勢(shì)，腦梗死區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是必然的[1]。神經(jīng)細(xì)胞是不可再生是長(zhǎng)期以來(lái)的共識(shí)，作為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cell，NSC）具有增殖、遷移及分化功能，在腦缺血后神經(jīng)損傷的修復(fù)過(guò)程中扮演重要角色[2]。壯通飲是治療腦梗死的壯醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)方，前期研究發(fā)現(xiàn)壯通飲影響新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察壯通飲對(duì)腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞歸巢后的神經(jīng)元功能的影響，為闡明壯通飲促進(jìn)神經(jīng)增殖分化為成熟神經(jīng)元后功能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)雄性健康SD大鼠240只，體重（250±10）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（批號(hào)：SCXK桂～0004）。

12試劑鼠抗BrdU單克隆抗體（批號(hào)：BM0201）、兔抗nestin多克隆抗體（批號(hào)：A00806-1）、兔抗MBP多克隆抗體（批號(hào)：BA0094）、兔抗SYN多克隆抗體（批號(hào)：A00941）、山羊抗兔IgG（批號(hào)：1512174091）、ABC試劑盒（批號(hào)：d0110816）、DAB試劑盒（批號(hào)：AR1022）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

2方法

21動(dòng)物分組將240只大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、壯通飲治療組、正常組，每組又設(shè)1、3、7、14、21、28d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠。

22藥物制備壯通飲：扶芳藤30g，參三七10g，黃花倒水蓮25g。藥材煎煮兩次，合并兩次煎液，蒸發(fā)去水分至濃稠狀，進(jìn)一步干燥，4℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前使用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為20 g/mL。

23MCAO模型建立參照Longa線栓法[4]制作MCAO模型。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)如下：①提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；②右眼Horner征；③爬行時(shí)向左劃圈；④站立時(shí)向左側(cè)傾倒。假手術(shù)組除不進(jìn)行大腦中動(dòng)脈線栓外，其余操作均同模型組。

24給藥方法壯通飲治療組在造模后給予壯通飲水煎液（按單位體重的劑量來(lái)算，大鼠的等效劑量相當(dāng)于成人用量的63倍[5]，灌胃，每日2次，每次748g生藥/kg，其他組同時(shí)給予等體積的無(wú)菌蒸餾水灌胃，灌胃至造模后1、3、7、14、21、28d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死時(shí)。

25BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞各組動(dòng)物均從處死前24h開(kāi)始，腹腔注射BrdU（50mg/kg），1次/4h，共4次，末次注射后12h處死動(dòng)物。

26組織切片制備各組大鼠于造模后1、3、7、14、21、28d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本，將腦組織移入多聚甲醛中4℃固定6h，取材，脫水，包埋，切片。

27免疫組化方法切片經(jīng)脫蠟，高溫修復(fù)后，加入配好的03%的過(guò)氧化氫甲醇溶液（甲醇80mL+001MKPBS 100mL+30%過(guò)氧化氫）30min，用001MKPBS溶液沖洗后，加入10%正常羊血清，室溫靜置30min，甩干分別加相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜。用001MKPBS溶液沖洗后，滴加生物素化二抗（山羊抗兔IgG），室溫靜置30min，用001MKPBS溶液沖洗后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫靜置30min，用001MKPBS溶液沖洗，采用SABC法染色，切片加葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺溶液顯色（不超過(guò)5min），自來(lái)水沖洗干凈，蘇木素復(fù)染2min，自來(lái)水沖洗，梯度酒精脫水，樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。

28觀察指標(biāo)分別觀察各指標(biāo)免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞的分布特點(diǎn)及形態(tài)特點(diǎn)。每只動(dòng)物各個(gè)指標(biāo)各取相對(duì)應(yīng)位置切片3張，放大倍數(shù)×400，隨機(jī)選取5個(gè)顯微鏡視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)取平均值。

29統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS 220統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，同組不同時(shí)間點(diǎn)及組間比較比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31BrdU免疫組化染色結(jié)果各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬齒狀回區(qū)域均見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。正常組和假手術(shù)組海馬區(qū)少量的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)多于假手術(shù)組（P<005）；壯通飲治療組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)多于模型組（P<005）。在不同時(shí)間點(diǎn)，正常組和假手術(shù)組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組、壯通飲治療組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)于第7天達(dá)到頂峰，之后呈現(xiàn)逐漸下降之勢(shì)。詳見(jiàn)圖1～4，表1。

32Nestin免疫組化染色結(jié)果在各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬齒狀回區(qū)域均有Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。正常組和假手術(shù)組大鼠的海馬區(qū)可見(jiàn)到少量的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)多于假手術(shù)組（P<005）。壯通飲治療組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)多于模型組（P<005）。在不同時(shí)間點(diǎn)，正常組和假手術(shù)組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量于造模后開(kāi)始增多，1個(gè)周達(dá)到高峰，之后逐漸下降，這與壯通飲治療組表達(dá)趨勢(shì)類似。詳見(jiàn)圖5～8，表2。

33MBP免疫組化染色結(jié)果在各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)和相對(duì)應(yīng)的區(qū)域均可見(jiàn)不同數(shù)目的MBP陽(yáng)性細(xì)胞。正常組和假手術(shù)組可見(jiàn)到大量的MBP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組MBP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量少于假手術(shù)組（P<005）。壯通飲治療組MBP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目多于模型組（P<005）。在不同時(shí)間點(diǎn)，正常組和假手術(shù)組MBP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。壯通飲治療組和模型組MBP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)于造模后3d開(kāi)始增多，14d達(dá)到頂峰。詳見(jiàn)圖9～12，表3。

34SYN免疫組化染色結(jié)果在各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)和相對(duì)應(yīng)的區(qū)域均見(jiàn)SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。正常組和假手術(shù)組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)少于假手術(shù)組（P<005）。壯通飲治療組第3、7、14天SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量多于模型組（P<005）。在不同時(shí)間點(diǎn)，正常組和假手術(shù)組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組造模后3d起，SYN陽(yáng)性細(xì)胞增多，第14天達(dá)到峰值。詳見(jiàn)圖13～17，表4。

4討論

壯通飲作為治療腦梗死的傳統(tǒng)壯醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)方，由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮組成。藥理學(xué)研究表明，三七總皂苷可通過(guò)上調(diào)Bcl-2、Nestin、BDNF[6]、EGF蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并且抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。扶芳藤水煎液、醇提液能明顯抑制血栓形成，延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間，縮短小鼠凝血時(shí)間和出血時(shí)間[7]；還能改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，以減輕局灶性腦缺血后腦細(xì)胞的缺血性損傷；通過(guò)抑制腦組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷進(jìn)行保護(hù)[8]。黃花倒水蓮總皂苷（PTS）可明顯延長(zhǎng)體外家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間 、凝血酶所致纖維蛋白凝固時(shí)間及APTT，體內(nèi)給藥可有效延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，而對(duì)PT無(wú)明顯影響，提示PTS可能通過(guò)對(duì)抗凝血通路的關(guān)鍵酶（凝血酶），影響內(nèi)源性凝血系統(tǒng)從而發(fā)揮抗凝血作用[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)壯通飲可影響新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化[3]，但對(duì)于它的歸巢后神經(jīng)元功能的影響，目前缺乏有力的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。國(guó)內(nèi)外對(duì)增殖后的神經(jīng)元的鑒定多還停留在形態(tài)學(xué)水平及特異性標(biāo)記表達(dá)方面，較缺乏是否具有成熟神經(jīng)元功能檢測(cè)的研究。歸巢后的神經(jīng)元能發(fā)展成為與受損區(qū)域神經(jīng)組織相一致的細(xì)胞類型，并能行使相應(yīng)的神經(jīng)功能是干細(xì)胞治療的關(guān)鍵。成熟神經(jīng)元不僅要具有典型的神經(jīng)元的形態(tài)、特異性標(biāo)記，還要求具有興奮性，能和其他神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，產(chǎn)生突觸電位。正常成熟的神經(jīng)元具有電生理功能，能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位是成熟神經(jīng)元的重要標(biāo)志。研究不僅可以在細(xì)胞層面通過(guò)Brdu、Nestin檢測(cè)觀察壯通飲干預(yù)下內(nèi)源性干細(xì)胞增殖、分化情況；還可以在功能層面通過(guò)MBP、SYN檢驗(yàn)歸巢后神經(jīng)元功能情況。

Brdu是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細(xì)胞增殖周期的S期代替胸腺嘧啶整合入新合成的DNA中，因而B(niǎo)rdu陽(yáng)性細(xì)胞可以用來(lái)標(biāo)記新增殖細(xì)胞[10]。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞被激活后，可以增殖分化，產(chǎn)生新的神經(jīng)細(xì)胞，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。Nestin又名神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白，屬于中間絲蛋白，主要在神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)一過(guò)性表達(dá)，當(dāng)干細(xì)胞向著終末細(xì)胞分化完成后，其表達(dá)停止[11-12]，因此實(shí)驗(yàn)選擇巢蛋白作為成熟神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物質(zhì)。MBP，即堿性髓鞘蛋白，是少突膠質(zhì)細(xì)胞的特殊標(biāo)記物，少突膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、協(xié)助神經(jīng)電信號(hào)的跳躍式高效傳遞，維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能[13]。有研究顯示，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成髓鞘膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺血應(yīng)激非常敏感，缺血缺氧將導(dǎo)致早期的髓鞘脫失，缺氧、缺血是導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷的主要因素之一[14-15]。成年SD大鼠腦缺血再灌注后急性期梗死區(qū)皮質(zhì)髓鞘相關(guān)蛋白（MyT1）基因表達(dá)增加，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生形成，從而參與腦缺血后的早期的損傷修復(fù)[16]。本研究中，模型組和壯通飲治療組由于受到腦缺血影響，少突膠質(zhì)細(xì)胞減少，MBP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)下降，從第3天起，模型組和壯通飲治療組MBP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)持續(xù)增加，第14天達(dá)到高峰，壯通飲治療組MBP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯高于模型組。這表明，腦缺血損傷后，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在分化過(guò)程中，一部分分化成了少突膠質(zhì)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、協(xié)助神經(jīng)電信號(hào)的跳躍式高效傳遞，維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能。壯通飲治療可以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化，并能起到正常神經(jīng)元功能作用。

突觸素（Synaptophysin，SYN）是突觸囊泡膜上的一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白，又稱P38，是神經(jīng)元形成神經(jīng)突觸的重要標(biāo)記蛋白，是突觸發(fā)生的標(biāo)志。突觸素還參與到不同神經(jīng)元之間的信息傳遞過(guò)程中，直觀反映突觸傳遞效能。腦梗死發(fā)生后，梗死灶中的突觸結(jié)構(gòu)解體，神經(jīng)元代謝能力和蛋白合成顯著減少，突觸素表達(dá)隨之減少[17-19]。因此SYN可用來(lái)作為檢測(cè)突觸的密度、分布和功能的重要標(biāo)記物。本研究中，正常組和假手術(shù)組由于神經(jīng)元未受到明顯損傷，彼此間維持正常接觸，表現(xiàn)為一定數(shù)量SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。部分神經(jīng)元于腦缺血早期凋亡，神經(jīng)元突觸聯(lián)系喪失，模型組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少。部分NSC被激活、增殖分化為神經(jīng)元，表現(xiàn)為SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)逐漸增多。壯通飲治療組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量明顯多于其他組，提示壯通飲可能通過(guò)促進(jìn)缺血腦組織形成新的神經(jīng)突觸，修復(fù)了腦缺血的神經(jīng)損傷。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2017-02-23編輯：梁志慶）