結核分枝桿菌Rv3872與Rv3873基因的克隆及重組真核表達載體的構建

李雙雙+李木楠+關松磊+張文慧+張林波

摘 要：目的：克隆結核分枝桿菌Rv3872與Rv3873基因，并構建Rv3872與Rv3873基因的重組真核表達載體，為研究這2個基因的功能奠定實驗基礎。方法：利用PCR技術克隆Rv3872與Rv3873基因序列，將其連接至pMD-18T載體，鑒定成功后將Rv3872與Rv3873序列插入真核表達載體pEGFP-C1，構建重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體，并進行質粒PCR、雙酶切以及測序驗證。結果：經測序比對后，Rv3872與Rv3873序列與GeneBank中公布的基因序列一致，重組載體構建成功。結論：成功構建重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體。

關鍵詞：結核分枝桿菌；Rv3872；Rv3873；真核載體

中圖分類號 R446 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）08-0012-04

Abstract：Objective：Cloning of Mycobacterium tuberculosis Rv3872 and Rv3873 gene and constructing recombinant eukaryotic expression vector of Rv3872 and Rv3873 gene.Methods：The whole gene of Rv3872 and Rv3873 sequence were cloned by PCR，and then the gene were inserted into the pMD-18T，then inserted it into the pEGFP-C1 after successful validation，constructing the recombinant eukaryotic expression vectors of pEGFP-C1-Rv3872 and pEGFP-C1-Rv3873，and then the plasmid was validated by PCR and double enzyme digestion and sequencing.Resluts：Rv3872 and Rv3873 were consistent with the gene sequences published in GeneBank after sequencing，and the recombinant vector was successfully constructed.Conclusion：The recombinant eukaryotic expression vectors pEGFP-C1-Rv3872 and pEGFP-C1-Rv3873 were successfully constructed.

Key words：Mycobacterium tuberculosis；Rv3872；Rv3873；Eukaryotic vector

結核病（Tuberculosis）是一種因感染結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）而引發的人畜共患傳染性疾病。2015年全世界新發結核病數量約為1 040萬例，據估計有140萬人死于結核病，還有40萬艾滋病毒感染者死于結核病[1]。結核分枝桿菌侵入機體后，主要由肺泡巨噬細胞吞噬、消化和摧毀，但結核分枝桿菌仍可以在這種惡劣的環境下生存和復制，其根本原因在于MTB可以調控宿主免疫、干擾細胞凋亡機制，抵御機體對病原菌的清除，進而在體內復制和傳播。通過DNA微陣列分析發現，弱毒性結核分枝桿菌與致病性結核分枝桿菌相比存在11個差異區（region of difference，RDs），與牛結核分枝桿菌相比存在16個RD區。RD1區是近年來人們研究的熱點，由RD1區分泌的蛋白有望成為結核病潛在的候選疫苗及診斷工具。Rv3872和Rv3873分別是PE和PPE家族成員，研究表明Rv3872與Rv3873編碼的PE35蛋白與PPE68蛋白在結核桿菌與巨噬細胞作用過程中發揮重要作用，能夠影響宿主細胞的功能[2，3]，但目前的研究尚不能完全闡述作用機制。本研究通過分子生物學手段，克隆Rv3872與Rv3873基因并構建重組真核表達載體，為下一步研究Rv3872和Rv3873在胞內的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和主要試劑 真核表達載體pEGFP-C1載體由廈門大學饋贈。限制性內切酶KpnI、BamHI、E×Taq酶、T4 DNA ligase、10 X T4 DNA Ligase buffer、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker（TaKaRa）；質粒提取試劑盒（Gene Mark）；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 （Axygen公司）、PCR產物純化試劑盒（Sangon Bitech）、pMD-18T載體（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 Rv3872、Rv3873基因的PCR擴增 根據Genbank中公布的Rv3872、Rv3873基因序列用Prime5.0進行引物設計，引物序列分別為P1 ：5′-ATGACAGAGCAGCAGTGGA-3′、P2：5′-CTATGCGAACATCCCAGT-3′、P3：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′、P4：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′，設計完成后送至上海生工生物工程有限公司合成。以人型H37Rv全基因組為模板，以P1與P2、P3與P4為引物擴增Rv3872、Rv3873基因，退火溫度為63.5℃、69℃，擴增體系為P1/P2、P3/P4各1μL，ExTaq mix 12.5μL，H37Rv全基因組1μL，ddH2O 9.5μL，PCR反應參數為：95℃預變性3min，95℃變性30s，53℃復性30s，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃再延伸l0min，4℃保溫l0min。反應結束后，制備1%瓊脂糖凝膠，130V，電泳25min。

1.2.2 重組pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873載體的構建及驗證 使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，將回收的PCR產物與pMD-18T連接，連接體系為T4 DNA ligase（350U/μL）1μL、10XT4 DNA Ligase buffer 1μL、pMD-18T3μL、回收目的基因5μL，金屬浴16℃過夜連接，16h。將重組質粒轉化E.coli DH5a，轉化后將菌液涂布與含有氨芐抗性的LB固培養基，37℃培養過夜，挑取陽性單菌落置于含氨芐抗生素的LB液體培養基內，振蕩過夜。提取重組質粒，并進行重組質粒PCR及雙酶切驗證，驗證成功后送至上海生工測序。

1.2.3 重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體的構建及鑒定 根據pEGFP-C1的載體圖譜，在目的基因上下游引物的5′端引入KpnⅠ和BamHⅠ，并加入與之相對應的保護性堿基，具體引物序列設計為：P5：5′-CGGGGTACCATGGAAAAAATGTCACA-3′、P6：5′-CGCGGATCCCTATTCGGCGAAGACG、P7：5′-CGGGGTACCATGCTGTGGACAGCAA-3′、P8：5′-CGCGGATCCTCACCAGTCGTCCTCTTCG-3′，以測序成功的pMD-18T重組質粒為模板，用帶酶切位點的引物進行PCR擴增。PCR擴增反應體系和反應條件同前，分別以P5與P6、P7與P8為引物擴增Rv3872和Rv3873基因，反應完成后，用SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒對目的條帶產物進行回收。對回收純化的PCR產物與pEGFP-C1載體分別用KpnI、BamHI雙酶切，純化回收。純化回收的基因與載體酶切產物連接，連接體系為T4 DNA ligase（350U/μL） 1μL、10XT4 DNA Ligase buffer 1μL、pEGFP-C1 3μL、回收目的基因5μL，金屬浴16℃過夜連接，16h。將重組質粒轉化E.coli DH5a，轉化后將菌液涂布與含有氨芐抗性的LB固培養基，37℃培養過夜，挑取陽性單菌落置于含氨芐抗生素的LB液體培養基內，振蕩過夜。提取重組質粒，并進行重組質粒PCR及雙酶切驗證，驗證成功后送至上海生工測序。

2 結果與分析

2.1 Rv3872、Rv3873基因的PCR擴增結果 經PCR擴增得到Rv3872、Rv3873基因，其片段長度分別為300bp、1 107bp左右，目的基因產物條帶清晰，條帶位置與預期位置相一致（圖1、2）。

2.2 重組pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873載體的構建及驗證結果 對構建的重組pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873載體進行質粒PCR驗證和雙酶切驗證，結果表明質粒PCR成功獲得長度分別為300bp、1107bp左右的片段，雙酶切產物有兩個條帶，與預期結果一致（圖3、4、5、6）。

2.3 重組pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表達載體的鑒定 利用質粒提取試劑盒提取重組質粒，將重組質粒用KpnⅠ和BamHⅠ進行質粒PCR及雙酶切驗證，發現與目的基因大小相一致，且條帶單一無雜帶，重組真核表達載體驗證成功后將其送至上海生工進行測序。對測序結果與Genbank中Rv3872、Rv3873公布的序列進行對比，經DNAMAN Version5.2.2分析顯示，二者氨基酸序列同源性均為100%，說明重組pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873和pEGFP-C1-Rv3878真核表達載體構建成功（圖7、8、9、10）。

3 討論

作為結核病的病原體，結核桿菌H37Rv全基因組共4 411 529bp，包括4 047個基因，其中4 018個為蛋白編碼基因[4]。MTB蛋白廣泛參與宿主細胞周期調控、各種代謝途徑、細胞運動與胞內運輸、RNA加工與轉錄后修飾、防御機制與信號轉導機制、影響細胞結構以及逃逸宿主免疫殺傷，此外還有一些未知的功能有待進一步研究[5，6]。

PE/PPE蛋白家族有多個成員涉及宿主免疫逃避[7-9]。其中PE35和PPE68分泌或與分枝桿菌細胞膜相關，參與介導宿主與病原體之間的相互作用[10，11]。有研究證明PE35和PPE68與分枝桿菌感染的細胞免疫應答相關[12，13]。PE35和PPE68依賴TLR2受體誘導THP-1巨噬細胞分泌IL-10和MCP-1并且降低IL-12p70的分泌，抵御宿主的清除[14-16]。pEGFP-C1載體為目前常用的真核細胞表達載體，含有PUC和SV40雙啟動子以及多克隆位點，保證外源基因能夠在大腸桿菌與哺乳動物細胞內復制。pEGFP-C1載體上含有EGFP綠色熒光蛋白，其為GFP的突變體，其熒光強度為GFP的35倍，有利于外源基因在細胞內的定位標記[17]。

作為MTB潛在的毒力因子，MTB感染宿主細胞后，PE35與PPE68胞內具體如何作用，目前尚不明確。為研究PE35與PPE68在宿主內的作用方式，本實驗通過基因工程技術構建pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873重組真核表達載體，經質粒PCR及質粒雙酶切驗證，DNA測序比對，與GenBank上公布的基因序列完全相同，載體構建成功，為進一步研究PE35、PPE68與宿主細胞的作用機制奠定基礎。

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