HPLC法測定地頂孢霉培養物中蟲草素的含量

鄭雪媚+羅少健+黃煒乾+唐謝芳

摘 要：目的：采用HPLC法測定地頂孢霉培養物中蟲草素的含量。方法：測定色譜條件為：色譜柱為C18，5μm，4.6mm×250mm，流動相為乙腈—水（95∶5），檢測波長為260nm。結論：蟲草素在1～50μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數R2為0.999 8；蟲草素的回收率為98.7%～101.6%；蟲草素的測定重復性RSD為0.62%。結論：該方法線性范圍寬、分析時間短、樣品前處理簡便、定量結果準確、重現性好，為其質量控制提供了依據。

關鍵詞：蟲草素；地頂孢霉培養物；HPLC；含量測定

中圖分類號 S476.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）08-0034-02

Abstract：Objective：High performance liquid chromatographic method was used for the determination of the content of the Cordycepin in the culture of Acremonium terricola.Determination of chromatographic conditions：column as C18（5μm，4.6mm×250mm），mobile phase as acetonitrile -water （95∶5，v/v），detection wavelength of 260nm.Conclusion：Cordycepin showed a good linear relationship at range of 1～50μg/mL（R2=0.999 8）.The recovery rate of cordycepin was 98.7% to 101.6%.The RSD Cordycepin was 0.62%.Conclusion：This method showed a wide linear range of the determination，a short analysis time，simple pre-treatment of samples，quantitative results and a good reproducibility.It provided the basis for the quality control.

Key words：Cordycepin；The culture of Acremonium terricola；HPLC；Determination of content

冬蟲夏草（Cordycepssp）是麥角菌科真菌寄生在鱗翅目蝙蝠科昆蟲蝙蝠娥幼蟲上的干燥子座和蟲體，是中國名貴藥材。冬蟲夏草的主要功能性成分為蟲草酸（Cordycepic）、蟲草素（Cordycepin）、蟲草多糖（Cordyceps polysaccharide）、氨基酸、生物堿、抗菌活性物質以及微量元素和免疫抑制劑等[1]。研究表明，蟲草具有提高免疫能力，促進特異性抗體的產生和增強機體免疫應答等功能。但蟲草素價格昂貴、資源有限，制約了其在畜禽生產中的應用。

地頂孢霉培養物主要成分是蟲草素，屬于蟲草飼料添加劑的一種，被收錄在農業部頒布的《飼料添加劑目錄》（2013年）中。其采用發酵工業工藝技術生產，實現蟲草生產的產業化，很大程度上低了生產成本，為蟲草素在養殖行業中規模化應用奠定了基礎。地頂孢霉培養物與天然蟲草具有基本相同的有效成分，并且人工培養方法簡單、便于大規模生產，利于在畜牧生產上推廣應用[2]。

本文按照中國獸藥典要求[3]，根據蟲草素的結構特點，建立了測定地頂孢霉培養物中蟲草素含量的HPLC法。該方法具有線性范圍寬、分析時間短、樣品前處理簡便、定量結果準確、重現性好等特點，為地頂孢霉培養物的質量控制提供科學依據。

1 實驗

1.1 試劑與儀器 日本島津SPD-20A液相色譜儀；柱溫箱CTO-20AC；超純水儀UPR-5T；超聲波清洗器KQ-500DE；天平METTLER MS105DU；蟲草素標準品來源：中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，乙腈為色譜純。

1.2 色譜條件 流動相∶乙腈∶水=95∶5；色譜柱：菲羅門C18（5μm，4.6mm×250mm）；檢測波長：260nm；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10μL。

1.3 對照品溶液的配制 （1）稀釋液：流動相。（2）對照儲備液：精密稱取對照品10mg（實際稱樣量10.56mg，對照品含量95.5%），以稀釋液溶解并稀釋至50mL，制成約200μg/mL的對照儲備液。（3）取上述對照儲備液5.0mL到100mL容量瓶中，加稀釋液定容，制成約10μg/mL的對照液。

1.4 樣品溶液的配制 精密稱取500mg試樣到100mL容量瓶中，加稀釋液適量溶解，超聲30min，定容，過濾即得。

1.5 系統適用性試驗 取上述10μg/mL的對照溶液10μL分別按1.2色譜條件下進樣，測定并計算柱效、分離度和拖尾因子（見表1）。

1.6 線性試驗 取上述對照品儲備溶液分別稀釋成50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL的系列對照品溶液，按1.2色譜條件測定，以峰面積對濃度進行回歸，蟲草素峰面積的回歸方程分別為：Y=58852X（R5=0.999 8），說明蟲草素在1～50μg/mL范圍內具有良好的線性關系（圖1）。

1.7 重復性試驗 精密吸取同一批供試品溶液，按1.2項色譜條件測定，進樣6次，得蟲草素峰面積的RSD為0.62%，表明樣品重復性良好（表2）。

1.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品（含量為1 904μg/g）約0.25g（共9份）置于100mL容量瓶中，分別加入對照儲備液1.5mL、2.5mL、3.5mL，按上述1.4項要求處理，進樣測定。樣品蟲草素的回收率為99.5%（表3）。

1.9 檢測限 在上述色譜條件下，測定最低檢測限為2ng（S/N≥3）。

1.10 供試品的測定 取3批樣品及標準溶液，按外標法測定，每批樣品進樣2次，計算樣品中蟲草素含量（圖2）。3批樣品的含量測定結果分別為1 905μg/g、2 005μg/g、2 101μg/g。2 結論

本實驗建立了HPLC法測定地頂孢霉培養物中蟲草素的含量的方法，測定色譜條件為：色譜柱為菲羅門 C18（5μm，4.6mm×250mm，流動相為水-乙腈（5∶95），流速為1.0mL/min，檢測波長為260nm，在1～50μg/mL范圍內線性關系良好。該方法具有線性范圍寬、分析時間短、樣品前處理簡便、定量結果準確、重現性好等特點，為其質量控制提供了依據。

參考文獻

[1]劉彥威，劉娜，劉利強.冬蟲夏草有效成分的研究進展[J].動物醫學進展，2004，25（3）：51-53.

[2]李洋，竇秀靜，王一臻，等.蟲草飼料添加劑對畜牧生產性能和免疫調節的影響以及其應用前景[J].中國畜牧雜志，2016，52（3）：67-71.

[3]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（二部）[S].北京：中國農業出版社，2010.

（責編：張宏民）