利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)開展大學(xué)生創(chuàng)新性試驗項目

李榮+張建平

摘 要：該文以構(gòu)建基因ILKAP的真核表達(dá)載體及通過Western-blotting進(jìn)行檢測的創(chuàng)新型試驗項目為例，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對在校本科生的創(chuàng)新性試驗項目的設(shè)計方案、實施及試驗結(jié)果與成效進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示，該實驗項目的實施，不僅可以培養(yǎng)學(xué)生的思維能力和創(chuàng)新意識，提高其實驗設(shè)計和實際操作的能力，而且提高了學(xué)生的主動性和團(tuán)隊協(xié)作能力。

關(guān)鍵詞：現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)；創(chuàng)新性試驗；試驗教學(xué)改革

中圖分類號 G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）08-0182-03

Abstract：Taking the experiment of “Construction of the eukaryotic expression vector of Flag-ILKAP-pCMV-2b and then detection of the expression by western-blotting in HEK293T cells” as an example，we expored the design scheme，experimantal implementations and results and analysis by the use of modern molecular biological techniques.The implementation of experiment program trained the capability and idea of innovation，foster students' experimental design and operation skills，and also enhanced the initiative and teamwork ability.

Key words：Modern molecular biology technology；Innovation experiment；Experimental teaching reform

創(chuàng)新是一個民族的靈魂，是國家綜合國力得以提高的根本，是科學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展的基礎(chǔ)。隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和時代進(jìn)步，社會對高等教育提出了更高的要求，具備“創(chuàng)新精神與創(chuàng)新能力”的創(chuàng)新型人才，已成為知識經(jīng)濟(jì)時代發(fā)展的迫切需求。大學(xué)生作為最具有自主創(chuàng)新能力的社會群體，是創(chuàng)新型國家建設(shè)過程中最為積極活躍的因素，因此，激發(fā)大學(xué)生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力，是構(gòu)建“創(chuàng)新型國家”的重要組成部分[1-3]。

近年來，我國提出了建設(shè)創(chuàng)新型國家的戰(zhàn)略，開始倡導(dǎo)創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)，各類高等院校也在積極探索創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)方案，盡管取得了一些經(jīng)驗，但到目前為止還沒有獲得突破性的進(jìn)展。創(chuàng)新能力和實踐能力的培養(yǎng)是教學(xué)改革建設(shè)的核心內(nèi)容和培養(yǎng)質(zhì)量的重要著力點。無論是培養(yǎng)應(yīng)用型、復(fù)合型和拔尖創(chuàng)新型人才的本科教育，還是培養(yǎng)“高端技能型”的高職教育，學(xué)生的創(chuàng)新能力、實踐能力培養(yǎng)質(zhì)量和水平已經(jīng)成為衡量一所高校人才培養(yǎng)質(zhì)量的重要因素，直接影響著高校、區(qū)域經(jīng)濟(jì)與社會的發(fā)展[4]。但是，創(chuàng)新能力和實踐能力的培養(yǎng)不是一朝一夕就可以完成的，需要長期的積累，需要學(xué)生在實踐中充分發(fā)揮創(chuàng)新精神，從而使學(xué)生的創(chuàng)新能力和實踐能力得以和諧發(fā)展。高校試驗教學(xué)是高校教學(xué)體系中的重要環(huán)節(jié)，對培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和實踐能力等方面起著不可替代的作用，尤其是對于生命科學(xué)這類實驗性學(xué)科更具有舉足輕重的作用[5]。但是，就現(xiàn)在的試驗教學(xué)來看還存在許多問題，按照目前的水平還不能滿足社會對創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的要求，這些問題主要體現(xiàn)在下面幾個方面：一是雖然生命科學(xué)領(lǐng)域，試驗技術(shù)不斷推陳出新，而試驗教學(xué)過程設(shè)備普遍陳舊，驗證手段落后，多為一些驗證性實驗，一般按照試驗指導(dǎo)書或黑板板書的實驗步驟進(jìn)行，學(xué)生無須深思熟慮，因而不利于培養(yǎng)學(xué)生的能動性和創(chuàng)新性；二是試驗教學(xué)一般一課一題，兩人一組，甚而至于為觀摩性試驗，學(xué)生無選擇性，并且前后試驗間無任何銜接性，因而無法激勵學(xué)生的縝密的思維邏輯性[6]。

針對以上問題，筆者結(jié)合本實驗室的條件和科研優(yōu)勢，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了基因ILKAP的真核表達(dá)載體及通過Western-blotting進(jìn)行檢測的創(chuàng)新型試驗項目。該項目融合了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等試驗內(nèi)容于一體，學(xué)生根據(jù)試驗?zāi)康呐c要求，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，獨立設(shè)計實驗技術(shù)路線，確定試驗方案，從而有利于學(xué)生實踐操作能力、創(chuàng)新能力和解決問題能力的鍛煉，取得了較好的試驗教學(xué)效果。

1 設(shè)計實驗項目

洞庭湖地區(qū)是日本血吸蟲的流行區(qū)域，而該區(qū)域的東方田鼠（Microtus fortis）是日本血吸蟲的非適宜宿主，也是唯一一種能感染血吸蟲但不致病具的哺乳動物。學(xué)生對該物種的這一特性產(chǎn)生了濃厚的興趣，因此在已有研究發(fā)現(xiàn)東方田鼠骨髓ILKAP基因具有一定的殺蟲特性的基礎(chǔ)上，學(xué)生選擇了該課題以中心法則為主線，將ILKAP基因克隆到真核表達(dá)載體pCMV-2b，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，建立ILKAP-Flag高表達(dá)的HEK293T細(xì)胞系，并通過Western-blotting來檢測其是否有表達(dá)[7]。此試驗設(shè)計涵蓋了本科階段生命科學(xué)專業(yè)的生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、細(xì)胞生物學(xué)等一系列課程，是一個較為完整的試驗設(shè)計項目。

2 實施試驗項目

真核表達(dá)載體pCMV-2b為實驗室保存，東方田鼠購買于實驗動物中心。首先，教師向?qū)W生下達(dá)此次創(chuàng)新型項目的任務(wù)書，學(xué)生根據(jù)此任務(wù)書查找相關(guān)文獻(xiàn)，并設(shè)計出試驗技術(shù)路線，安排試驗進(jìn)程，提出在試驗實施過程中擬解決的問題，從而提高了學(xué)生的積極性。其次，學(xué)生在試驗過程中常出現(xiàn)的問題有：不知如何設(shè)計引物，為何要在上下游引物添加酶切位點，怎樣選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶；PCR過程中不知如何設(shè)計退火溫度；進(jìn)行轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的量的估計，Western-blotting沒有設(shè)計內(nèi)參等等系列問題。因此，教師有必要先對學(xué)生的試驗設(shè)計進(jìn)行指導(dǎo)，并要經(jīng)常進(jìn)入實驗室解決學(xué)生遇到的問題，不定時檢測學(xué)生的試驗進(jìn)度，同時督促學(xué)生在試驗過程中養(yǎng)成良好的原始試驗記錄習(xí)慣，以及遇到問題時如何妥善處理問題能力的培養(yǎng)。

3 試驗項目結(jié)果與分析

提取室內(nèi)封閉群東方田鼠骨髓和日本血吸蟲童蟲總RNA，用RT-PCR方法檢測ILKAP在正常生理狀態(tài)下的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果顯示：ILKAP在東方田鼠骨髓和日本血吸蟲童蟲中均有表達(dá)，根據(jù)ILKAP全長酶切位點分析結(jié)果和質(zhì)粒pCMV-Tag 2b多克隆酶切位點分析，選擇Sma I和Not I作為限制性核酸內(nèi)切酶，酶切過夜，T4 DNA 連接酶16℃過夜，連接目的基因和去磷酸化處理后的空載體，重組后的質(zhì)粒經(jīng)酶切初步鑒定后，送Invitrogen公司測序驗證（圖1）。重組質(zhì)粒Flag-ILKAP-pCMV-2b構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，其中空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染作為空白對照，培養(yǎng)細(xì)胞48h后收集上清用于Western-blotting檢測。通過Western blotting，SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜后，以Flag抗體與PVDC膜共孵育，發(fā)現(xiàn)只有實驗組有條帶，而對照沒有條帶出現(xiàn)（圖2）。

在整個實驗過程中，學(xué)生遇到了很多“攔路虎”，例如在設(shè)計引物時不知如何利用生物學(xué)軟件primer和oligo相結(jié)合，原始引物設(shè)計好后沒有加酶切位點及保護(hù)堿基，其次在對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，退火溫度的摸索花了很長時間，在這個摸索的過程中學(xué)會了如何通過查閱文獻(xiàn)以同種屬的物種的基因克隆溫度作為參考，也學(xué)會了梯度PCR的使用；最后在用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，不知如何評估細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染后不知何時換液，也不知是否需要添加其他試劑等等。但是學(xué)生們都找到了解決問題的方法，最終獲得了較為理想的實驗結(jié)果。

4 試驗效果

通過實驗項目的實施，學(xué)生在以下幾個方面有了較大的收獲：（1）為保證整個實驗項目的順利進(jìn)行，首先得從全局著手設(shè)計實驗方案，促進(jìn)學(xué)生自主的去學(xué)習(xí)課本及試驗指導(dǎo)書之外的知識；（2）學(xué)生通過參加科研項目，培養(yǎng)了他們的團(tuán)隊協(xié)作能力，同時也提高了學(xué)生的溝通能力，項目完成后，學(xué)生還需整理相關(guān)資料和數(shù)據(jù)，完成并撰寫，為日后畢業(yè)論文的協(xié)作打下了良好的基礎(chǔ)；（3）試驗項目的實施極大地激發(fā)了學(xué)生的求知欲，有助于學(xué)生創(chuàng)新意思的培養(yǎng)以及獨立試驗技能的提高，同時也通過試驗結(jié)果感受到了科學(xué)探究所帶來的成就感。例如，在經(jīng)歷了western blotting的多次失敗的磨練后，到現(xiàn)在感覺只要抗體合適，幾乎就沒有他們做不出來的分子，通過系列試驗的成功，給了學(xué)生無窮的自信，使學(xué)生對生物科學(xué)產(chǎn)生了濃厚的興趣，同時也在試驗過程中感受到了成功的喜悅。（4）在試驗過程中，我們明顯感覺到學(xué)生逐步形成了發(fā)現(xiàn)問題、思考問題、解決問題的科學(xué)意識，同時分析和解決問題的能力大大加強(qiáng)。比如，在做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試驗時，學(xué)生做了很多嘗試來提高轉(zhuǎn)染效率。為了確保轉(zhuǎn)染在對數(shù)生長期內(nèi)進(jìn)行，學(xué)生先繪制培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線、確定其對數(shù)生長期，然后再著手做轉(zhuǎn)染；其次在保證DNA的質(zhì)量的前提下，學(xué)生按照DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例做了曲線分析，看看reporter的表達(dá)效率，以求做到最好的轉(zhuǎn)染效率。（5）極大提高了學(xué)生的試驗操作技能。我們平時理論課和實驗課上的一些內(nèi)容例如DNA的瓊脂糖凝膠電泳，雖然理論上有強(qiáng)調(diào)，但實際訓(xùn)練卻很少，尤其是對于大二年級的學(xué)生而言很多實驗根本就沒有開展過，創(chuàng)新實驗項目的開展，從實驗準(zhǔn)備到試驗結(jié)果的觀察都是一個全新的體驗，學(xué)生通過一些列的的生物學(xué)試驗，提高了學(xué)生的動手操作能力，鍛煉了試驗思維，對于學(xué)生而已收獲頗豐，這是傳統(tǒng)的試驗所無法到達(dá)的試驗效果。

5 結(jié)語

高等院校生物科學(xué)專業(yè)開展創(chuàng)新型實驗是傳統(tǒng)的驗證性試驗向研究創(chuàng)新性試驗的轉(zhuǎn)變，有利于培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和探索科學(xué)理論的強(qiáng)烈欲望，能為改進(jìn)實驗教學(xué)改革提供新的思路，有利于多方面、多層次、全方位地培養(yǎng)學(xué)生的素質(zhì)和能力。大學(xué)生在校期間參加科研項目，無論是對于專業(yè)知識的深入了解還是對于日后的就業(yè)問題，都有很大的益處。今后將繼續(xù)深入探索生物科學(xué)試驗教學(xué)改革、試驗創(chuàng)新意識的培養(yǎng)和試驗技能的提高三者之間的相互整合，以利于創(chuàng)新型、應(yīng)用型的復(fù)合型人才的培養(yǎng)。

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（責(zé)編：張宏民）