慢性HBV感染不同階段患者樹突狀細胞亞群的表達差異

陳偉霞， 王 磊， 劉 洋， 季 光， 邢練軍,3

(1 上海中醫藥大學， 上海 201203； 2 上海中醫藥研究院脾胃病研究所， 上海 200032；3 上海中醫藥大學附屬龍華醫院 脾胃病二科， 上海 200032)

論著/病毒性肝炎

慢性HBV感染不同階段患者樹突狀細胞亞群的表達差異

陳偉霞1， 王 磊2， 劉 洋2， 季 光2， 邢練軍2,3

(1 上海中醫藥大學， 上海 201203； 2 上海中醫藥研究院脾胃病研究所， 上海 200032；3 上海中醫藥大學附屬龍華醫院 脾胃病二科， 上海 200032)

目的 探討HBV相關疾病患者外周血樹突狀細胞亞群在不同病程中的變化及臨床意義。方法 選取上海中醫藥大學附屬龍華醫院肝病科HBV攜帶者(HBV攜帶組)、CHB患者(CHB組)、乙型肝炎肝硬化患者(肝硬化組)、原發性肝癌患者(肝癌組)(均為HBV相關疾病)及健康志愿者(正常組)各20例，采用流式細胞分析其外周血樹突狀細胞(DC)亞群的變化。多組間比較采用kruskal-wallisH檢驗，進一步兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。結果 不同類型HBV感染者與正常人外周血髓樣樹突細胞 (mDC)和漿細胞樣樹突細胞(pDC)比較結果顯示，不同類型的HBV感染者與正常組之間mDC數量比較差異有統計學意義(χ2=33.629，P<0.001),進一步比較發現肝硬化組、肝癌組患者外周血mDC的數量均低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；不同類型的HBV感染者與正常組之間pDC數量比較差異有統計學意義(χ2=13.602,P=0.009)，進一步比較發現肝癌組患者外周血pDC數量均低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異有統計學意義(P值均<0.05)；肝硬化組患者外周血pDC數量低于CHB組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 慢性HBV感染不同階段的患者其DC亞群表達存在顯著差異，其中肝硬化和肝癌患者DC亞群數量最少，DC的數量可能是病情演變和預后評判的參考依據。

肝炎， 乙型， 慢性； 肝硬化； 肝腫瘤； 樹突細胞

持續性HBV感染和炎癥反應可導致包括慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化以及肝細胞癌(HCC)等在內的一系列慢性肝病[1]。當機體感染HBV后，HBV并不直接損傷肝細胞，而是與體內的免疫細胞之間相互作用。筆者在前期研究中發現肝硬化和肝癌患者的T淋巴細胞免疫應答低于CHB患者。樹突狀細胞(DC)是人體內功能最強的抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)，是啟動適應性免疫反應的多功能細胞[2]，也是機體抗病毒免疫應答的重要功能細胞[3]，它的成熟、功能缺陷是造成HBV持續感染的重要原因[4]。本研究通過觀察健康者、HBV攜帶者、CHB患者、肝硬化和肝癌患者的外周血單個核細胞(PBMC)DC亞群的變化，探討HBV感染后不同疾病轉歸與APC(DC)免疫功能的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年3月-2015年1月于上海中醫藥大學附屬龍華醫院肝病科住院的HBV相關疾病患者及體檢中心健康志愿者的臨床資料。其中，HBV攜帶者(HBV攜帶組)、CHB患者(CHB組)、乙型肝炎肝硬化患者(肝硬化組)、原發性肝癌患者(肝癌組)、健康志愿者(正常組)各20例。CHB、乙型肝炎肝硬化的診斷標準均參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[5]；原發性肝癌的診斷符合原發性肝癌的臨床診斷與分期標準。入選患者半年內均未接受免疫調節及抗病毒治療。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗室檢查 采用全自動生化分析儀檢測ALT水平，正常范圍以ALT<69 U/L為標準。采用ELISA檢測HBsAg、HBeAg血清免疫標志物。

1.2.2 DC的分離及檢測 在無菌條件下采集各組患者及健康志愿者外周血1.5 ml，用PBS進行等倍稀釋，混和均勻。15 ml的離心管中加入2倍血液的淋巴細胞分離液6 ml，將混勻的血液緩慢加入在含有淋巴細胞分離液的離心管中，室溫800 r/min離心20 min，離心管內分為三層，上層為血清和PBS液，下層主要為紅細胞，中層為淋巴細胞分離液。在上、中層界面處以單個核細胞為主的灰白色云霧帶，輕輕抽取灰白色云霧層的細胞加2倍PBS懸浮，依次1000 r/min、800 r/min各10 min、5 min洗滌2次，洗滌后的PBMC加入100 μl DMSO和900 μl 1640培養基混勻在凍存管中放入凍存盒，-80 ℃冰箱過夜。

1.2.3 外周血髓樣樹突細胞(mDC)和漿細胞樣樹突細胞(pDC)成熟度檢測 將各組凍存的PBMC經37 ℃水浴箱孵育5 min后，轉入1.5 ml EP管，1200r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 1 ml，1200 r/min洗滌5 min，棄上清后加PBS 200 μl，混勻吸出50 μl。置于EP管中，分別再加入FITC標記的Lin-1抗體5 μl、PE標記的CD123 2.5 μl、Percp標記的HLA-DR APC熒光CD11c抗體2 μl，避光孵育20 min。流式細胞儀各門設定：P5為排除碎片和細胞；P6為圈定Lin弱陽性和陰性細胞；P7為HLA-DR/CD123細胞，P8為CD11c+細胞。流式檢測mDC為Lin-，CD11c+和HLA-DR+；pDC為Lin-，CD123+和HLA-DR+。采用Cellquest軟件分析比較各組成熟mDC和pDC(圖1)。

圖1 流式細胞儀示意圖 a：P5門；b：P6門；c：Q10UR為HLA-DR+CD123+細胞，即pDC；d：Q11UR為 CD11c+HLA-DR+細胞，即mDC

2 結果

2.1 一般資料 各組在年齡、性別、不同類型的HBV感染者HBsAg及HBeAg構成比例等方面差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 各組一般資料比較

2.2 不同類型的HBV感染者與正常組mDC及pDC亞群比較 不同類型的HBV感染者與正常組之間mDC數量比較差異有統計學意義(χ2=33.629，P<0.001)，進一步比較發現肝硬化組、肝癌組患者外周血mDC數量低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。不同類型的HBV感染者與正常組之間pDC數量比較差異有統計學意義(χ2=13.602，P=0.009)，進一步比較發現肝癌組患者外周血pDC數量低于正常組、CHB組和HBV攜帶組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；肝硬化組患者外周血pDC數量低于CHB組，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同類型HBV感染者及正常組mDC及pDC比較

注：與正常組比較，1)P<0.05；與HBV攜帶組比較，2)P<0.05；與CHB組比較，3)P<0.05

3 討論

全球有超過3億的HBV攜帶者，其中有相當數量的患者最終會發展肝硬化、肝細胞癌等嚴重肝病[6]。HBV慢性感染主要是由于HBV逃逸免疫識別并誘導DC參與宿主免疫耐受所致，病毒高復制水平的同時抗病毒免疫應答抑制是乙型肝炎慢性感染的根本機制[7]。

DC是一組以表面有許多樹枝狀突起、核不規則為特征的細胞。人DC起源于造血干細胞，根據其起源可分為：(1)髓樣干細胞在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子刺激下分化mDC，與單核細胞及粒細胞有共同的祖細胞；(2)來源于淋巴樣干細胞的淋巴樣DC或pDC，與T淋巴細胞和NK細胞有共同的前體細胞[8]。mDC在抗原遞呈、激發和參與 T淋巴細胞免疫過程中發揮了重要的作用， 還可以產生大量的IL-2細胞因子，誘導輔助性T淋巴細胞1類免疫應答及細胞毒性反應；pDC可通過產生大量Ⅰ類干擾素而直接參與針對病毒和微生物感染的固有免疫應答[9]。目前自身免疫清除是治療HBV的唯一有效方式，而免疫治療也成為CHB治療的關鍵步驟，眾多研究[2,10]發現HBV聯合自體DC治療對于CHB患者有較好的療效。

張宜俊等[10]通過CHB患者外周血制備DC，觀察其生長和形態，發現CHB患者的DC數量較少，胞質突起較少，形態不典型，處于不成熟狀態。進一步闡明了HBV感染者DC數量減少，功能下降，不能有效地攝取、加工和提呈抗原，進而無法產生有效的針對 HBV 特異的免疫應答、徹底清除 HBV，可能是導致HBV持續感染的原因。同樣，Wang等[11]研究發現與健康人相比，HBV感染者在體外培養刺激DC的增殖能力和數量明顯減少。Duan等[12]研究也發現正常健康者外周血的pDC數量要高于CHB、肝硬化患者。翁永強等[13]發現乙型肝炎肝硬化、肝癌患者與健康志愿者外周血PBMC和DC的數量及表型表達降低，以肝癌患者降低最為明顯。上述結論與本研究結果一致，HBV感染不同階段的患者均存在DC功能不成熟、表型不成熟等缺陷，可能與宿主免疫系統的清除能力有關。

本研究以HBV感染不同階段的患者細胞免疫為切入點，探討HBV感染不同疾病階段的細胞免疫學基礎，初步結果發現HBV感染者外周DC亞群較正常健康者降低，其中肝硬化和肝癌患者存在明顯DC亞群缺乏。但由于樣本量較少，研究結果可能存在一定的偏倚和不足，今后應擴大樣本量，從分子生物學和免疫學角度深入研究HBV慢性感染的發病機制，為HBV感染的治療提供更好的指導方向。

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引證本文：CHEN WX, WANG L, LIU Y, et al. Expression of dendritic cell subsets in patients with different stages of chronic HBV infection: a comparative analysis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(3): 458-461. (in Chinese)

陳偉霞， 王磊， 劉洋， 等. 慢性HBV感染不同階段患者樹突狀細胞亞群的表達差異[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(3): 458-461.

(本文編輯：邢翔宇)

Expression of dendritic cell subsets in patients with different stages of chronic HBV infection: a comparative analysis

CHENWeixia,WANGLei,LIUYang,etal.

(ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective To investigate the changes in peripheral blood dendritic cell (DC) subsets in patients with different stages of hepatitis B virus (HBV)-associated disease and related clinical significance. Methods A total of 20 HBV carriers (HBV carrier group), 20 chronic hepatitis B (CHB) patients (CHB group), 20 hepatitis B cirrhosis patients (cirrhosis group), and 20 primary liver cancer patients (liver cancer group), all of whom had HBV-associated disease and were selected from Department of Hepatology, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditiond Chinese Medicine, as well as 20 healthy volunteers (normal group), were included in this study flow cytometry was used to measure the changes in DC subsets. Comparison between multiple groups using Druskal-WallisHtest and further comparison using of Wilcoxon Rant test. Results According to the results of myeloid dendritic cells (mDCs) and plasmacytoid dendritic cells (pDCs) in patients with different types of HBV infection and normal population, there was a significant difference in the number of mDC between patients with different typers of HBV infection and normal population(χ2=33.629,P<0.001)，and the cirrhosis group and the liver cancer group had significantly lower numbers of mDCs in peripheral blood than the normal group, CHB group, and HBV carrier group (allP<0.05). There was a significant difference in the number of pDC between patients with different types of HBV infection and normal population(χ2=13.602,P<0.009), and the liver cancer group had a significantly lower number of pDCs in peripheral blood than the normal group, CHB group, and HBV carrier group (allP<0.05). The cirrhosis group had a significantly lower number of pDCs in peripheral blood than the CHB group (P<0.05). Conclusion There are significant differences in the expression of DC subsets between patients with different HBV-associated diseases, and the number of DCs may be used as a reference for evaluating disease progression and prognosis.

hepatitis B, chronic; liver cirrhosis; liver neoplasms; dendritic cells

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.012

2016-10-26；

2016-12-01。

國家自然科學基金項目(81302891)；上海市自然科學基金項目(14ZR1441600)

陳偉霞(1987-)，女，博士，主要從事中西醫結合防治消化道腫瘤方面的研究。

邢練軍，電子信箱：xingdoctor@126.com。

R512.62

A

1001-5256(2017)03-0458-04