臺東蘇鐵中RNA不同提取方法的比較

沈成才 （北京師范大學克拉瑪依附屬學校 新疆克拉瑪依 834000）

蘇鐵（Cycas revoluteThunb），蘇鐵科蘇鐵屬，又名鳳尾蕉、金代、鐵樹等，蘇鐵科植物是世界上最古老的裸子植物，被譽為“植物的活化石”［1］。蘇鐵對研究種子植物的起源與演化、種子植物的區系和古氣候的變遷、基因表達與調控、遺傳多樣性和親緣關系等都有重要意義［2］。蘇鐵RNA的提取對生物學特性和分子生物學的研究至關重要，較高質量的RNA可為Northern雜交、cDNA文庫建構、RT-PCR及RNA編輯位點的研究等提供保證。

現階段植物總RNA的提取技術已經比較成熟，有多種方法可供選擇，例如胍鹽法、SDS法、CTAB法、苯酚法、LiCl沉淀法、異硫氰酸胍法，商品化試劑盒法等［3］。RNA的提取方法很多，但這些方法在RNA提取材料上都具有一定針對性，適用范圍有限，尤其是裸子植物的RNA提取相對較難。由于蘇鐵中大量的多糖、多酚等次級代謝產物在細胞破碎后會以不同方式干擾RNA的提取，例如：酚類物質氧化后可使RNA活性喪失，多糖可形成難溶膠狀物與RNA沉淀，內源RNase及操作體系中的外源RNase的污染［4］，加之RNA的不穩定性，使得蘇鐵中RNA的提取難度加大。

通過閱讀大量文獻，發現針對蘇鐵中RNA提取方法的研究較少，李璐等人在常規的CTBA法中，加入硼砂和巰基乙醇提取蘇鐵葉片中的RNA［5］。現階段，由于小麥總RNA的提取技術比較成熟［6］。因此，筆者選擇小麥做參照，采用異硫氰酸胍法、試劑盒法和CTAB法提取蘇鐵和小麥RNA，以確定最佳提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 臺東蘇鐵（Cycas taitungensis），購買于西安三森市場。

1.1.2 實驗試劑 CTAB,PVP，2-巰基乙醇，LiCl,DEPC，Tris-base，EB， 硼酸，EDTA－2Na， 溴酚藍，十二烷基肌氨酸鈉，異硫氰酸胍，檸檬酸鈉，水飽和酚酸，亞精胺，植物RNA提取試劑盒，無水乙醇，液氮，氯仿，異戊醇，異丙醇。

GT溶液（4 mol/L異硫氰酸胍，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.5%十二烷基肌氨酸鈉）；RNA提取液（20 g/L CTAB，20 g/L PVP，50 mmol/L EDTA，4.0 mol/L NaCl）；10×TBE 電泳緩沖液 （108 g Tris；55 g 硼酸；9.3 g EDTA－2Na；1 000 mL；pH 8.0）；1%瓊脂糖凝膠（0.2 g瓊脂糖；1×TBE緩沖液 20 mL；2 μL EB）； 3 mol/L NaAc （pH 5.8），2 mol/L NaAc（pH 4.8），4 mol/L LiCl，0.1%DEPC 水。 天根公司植物總RNA提取試劑盒。

1.1.3 實驗儀器 DYY-12型電泳儀；PB-10型pH計；BS-124S型電子天平；YDS-30型液氮生物容器；DSX-280A型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋；JB-3定時恒溫磁力攪拌器；DYCP-31DN電泳槽；Centrifuge 5804R型臺式冷凍離心機；Centrifuge 5417C型臺式高速離心機；AGX-7601型通風櫥；精密微量移液器；GDS-8000型凝膠成像系統；UNICAM UV300型紫外分光光度計；HH-2B型數顯恒溫水浴鍋；DW-86L368型超低溫冰箱；GZX-9140MBE型數顯鼓風干燥箱；PE手套，離心管，槍頭。

1.2 方法

1.2.1 異硫氰酸胍法提取植物葉片總RNA

1）稱取0.1 g新鮮植物葉片，加入液氮研磨成粉末，移入預冷的1.5 mL Eppendorf管中。

2）加入 300 μL GT 溶液，混勻；加入 30 μL 2 mol/L NaAc（pH 4.8），反復振蕩混勻；加入300 μL 酚酸與 100 μL 氯仿，混勻。

3）4℃，8 000 r/min 離心 15 min， 棄沉淀，取上清移至用DEPC水處理過的另一干凈離心管中，加入2.5倍體積無水乙醇，-20℃放置5～6 h。（-20℃可放置過夜）

4）4℃，8 000 r/min 離心 15 min， 棄上清液。在沉淀中加入100 μL 4 mol/L LiCl，使沉淀溶解。

5）12 500 r/min 離心 15 min，棄上清液；在沉淀中加入100 μL滅菌后的DEPC水，混勻后再加入 50 μL氯仿，50 μL水飽和酚酸混勻。

6）12 500 r/min離心5 min，吸上清液移至另一DEPC水處理過的1.5 mL Eppendorf管，加入等體積氯仿。

7）12 500 r/min離心5 min。吸上清液移至另一DEPC水處理過的1.5 mL Eppendorf管，加入1/10體積 3 mol/L NaAc（pH 5.8）和 2倍體積無水乙醇，-20℃放置過夜。

8）12 500 r/min離心 5 min，小心吸去上清液，RNA沉淀在室溫下稍干燥。

9）加入20 μL DEPC處理過的滅菌水溶解，取5 μL樣品經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（100 V，100 mA，20 min）RNA 質量， 并取 2 μL 樣品加入498 μL DEPC處理過的水，用紫外分光光度計測定RNA濃度；其余樣品-20℃保存備用。

1.2.2 CTAB法提取植物葉片總RNA

1）取不超過50 mg植物葉片于研缽中，加液氮研磨成粉末狀;然后轉入1.5 mL離心管中。

2）加入 600 μL RNA 提取液（預先在 65℃水浴中保溫 1 h），3 μL 亞精氨和 12 μL β-巰基乙醇，混勻。

3）加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1 即 624 μL∶26 μL），混勻，12 000 r/min，4℃離心 10 min。 用移液槍小心吸取上層清液于另一離心管中，重復抽提一次（20 μL β-巰基乙醇）。

4）取上清液于另一支1.5 mL離心管中，加入1/4體積的 10 mol/L LiCl混勻過夜（2 h）。

5）12 000 r/min，4℃離心 20 min。 去上清液，用 100 μL/200 μL DEPC 溶解沉淀。

6）再加上等體積的氯仿-異戊醇抽提，12 000 r/min，4℃ 10 min，然后用移液槍小心吸取上層清液于另一支1.5 mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇沉淀RNA，-20℃，2 h。

7）12 000 r/min，4℃離心 20 min。 去上清液，用 750 mL的乙醇洗滌沉淀，加入20 μL DEPC溶解沉淀，取 5 μL樣品經 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（100 V，100 mA，20 min） RNA 質量，并取2 μL樣品加入498 μL DEPC處理過的水，用紫外分光光度計測定RNA濃度；其余樣品-20℃保存備用。

1.2.3 試劑盒法

1）取不多于0.1 g研磨過的冷凍蘇鐵葉片，加入0.5 mL提取試劑，振蕩至徹底混勻。

2）室溫放置5 min。平放離心管使表面積增大。

3）12 000 r/min，4℃離心 1 min。 上清液轉入新的1.5 mL離心管中。

4）加入 0.1 mL NaCl，溫和混勻。

5）加入0.3 mL氯仿上下顛倒混勻。

6） 12 000 r/min，4℃離心 10 min。 取上層水相于新的1.5 mL離心管中。（重復5、6）

7）加所得水相等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min。

8）12 000 r/min，4℃離心 10 min。 去上清液，加1 mL無水乙醇。

9）12 000 r/min，4℃離心 3 min。倒出液體，室溫晾干。

10）加 50 μL DEPC 水，充分溶解，取 5 μL 樣品經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（100 V，100 mA，20 min）RNA 質量， 并取 2 μL 樣品加入 498 μL DEPC處理過的水，用紫外分光光度計測定RNA濃度；其余樣品-20℃保存備用。

2 結果和分析

通過比較3種RNA提取方法的電泳結果，可以看出使用改良的異硫氰酸胍法提取蘇鐵的RNA，28S RNA和18S RNA條帶邊緣清晰，DNA含量少（圖1）；試劑盒法得到的RNA含量很多，但28S RNA和18S RNA條帶模糊，拖帶較為嚴重。DNA條帶粗而亮，說明對DNA的處理不充分（圖2）；CTAB法提取的RNA的電泳結果顯示，DNA條帶較亮，DNA雜質較為明顯，且28S RNA和18S RNA條帶呈彌散狀，表明RNA分解較為明顯（圖3）。可見，使用改良的異硫氰酸胍法提取蘇鐵總RNA較為合適。

圖1 異硫氰酸胍法提取蘇鐵總RNA的電泳結果

圖2 試劑盒法提取蘇鐵總RNA的電泳結果

圖3 CTAB法提取蘇鐵總RNA的電泳結果

3 討論與小結

CTBA法中加入的β-巰基乙醇能有效抑制酚類物質的氧化，用氯仿-異戊醇、LiCl沉淀分離出RNA，但效果并不理想，可能并不適合提取臺東蘇鐵的RNA，或有待進一步改進；試劑盒法提取臺東蘇鐵的RNA含量多，但28S RNA和18S RNA的條帶邊緣彌散，樣品中混有較多DNA，降低了產物的純度和效率。購買的試劑盒價格較高，一次提取材料相對較少，增加了實驗成本。

改良的異硫氰酸胍法提取蘇鐵總RNA的方法中，異硫氰酸胍是一種烈性蛋白變性劑，可抑制RNase的活性，有效解離核蛋白與核酸復合體，加入的LiCl可以選擇性沉淀RNA，用酚、氯仿、無水乙醇等有機溶劑純化RNA。整個提取RNA的過程只需勤換一次性PE手套，謹慎在冰上操作，即可提取出質量很好的RNA。28S RNA和18S RNA條帶明亮、清晰，且28S RNA的亮度在18S RNA條帶的2倍以上，A260/A280比值在2.0左右。提取的臺東蘇鐵RNA樣品，在-20℃保存1個月后仍可用于后續RT-PCR。改良的異硫氰酸胍法不僅可以提取大量材料，還得到了純度較高的RNA，且樣品中混有的DNA也比較少，有利于一系列基因的下游操作［7］。

可見，采用改良的異硫氰酸胍法比較適合提取臺東蘇鐵的總RNA，不僅可以得到用于分子生物學研究的高質量RNA，還節約了實驗成本。此方法的研究，為蘇鐵的分子生物學乃至生物進化等方面的研究提供了良好的技術保證，也為裸子植物的RNA提取方法提供了參考。

［1］Takahiko T， Tatsuya W,Masahiro S.Comparative analysis of RNA editing wites in higher plant chloroplasts.Journal of Molecular Evolution,2001，53(4-5):327.

［2］傅瑞樹.蘇鐵研究的現狀及展望.武夷科學，2000(16):187.

［3］E M Moller,G Bahnweg,H Sandermann,et al.A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi,fruit bodies,and infected plant tissues.Nucleic Acids Research,1992,20(20):6115.

［4］楊占軍，谷守琴，張健.幾種植物組織總RNA提取方法的特點及疑難對策.安徽農業科學，2009,37（18）：8341.

［5］LI Lu,FU Qiantang,YU Diqiu.An effective protocol for the isolation of RNA from Cycad Leaves.Acta Botanica Yunnanica.2008,30(5):593.

［6］Tadamasa Sasaki,Yasushi Yukawa,Tetsuya Miyamoto,et al.Identification of RNA EditingSites in chloroplast Transcripts from the Maternal and Paternal Progenitors of Tobacco(Nicotiana tabacum):Comparative analysisshows the involvement of distinct trans-factors for ndhB editing.Molecular.Biology and Evolution,2003,20(7):1028.

［7］Wang Jie,Wang Quan,et al.Comparison and analysis of RNA extracting method from different plant tissues.Journal of Beijing University of Agriculture.2015,30(1):76.

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