斑馬魚胚胎用于汽車尾氣顆粒物毒性監測的可行性

超克+楊景峰+李佳怡

摘要：概述了汽車尾氣的污染狀況及危害、汽車尾氣顆粒物的檢測、斑馬魚的優點，探討了斑馬魚用于汽車尾氣顆粒物毒性檢測的可行性。

關鍵詞：汽車尾氣顆粒物；生物監測；斑馬魚胚胎；毒性

中圖分類號：X830.2 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2017）02-0074-05

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.02.014

現今，隨著科學技術的發展以及經濟水平的提高，汽車已經成為人類不可缺少的交通運輸工具。它給人們的生活和工作帶來了便利的同時，也帶來了極大的污染：汽車尾氣危害人體健康，破壞城市建筑物及景觀，對人類的生存環境造成極大影響[1]。伴隨汽車工業的快速發展、汽車產量和保有量不斷增加，汽車尾氣大量排放已逐漸成為大氣的主要污染來源[2-3]。

1 汽車尾氣的危害及污染狀況

汽車尾氣排放對環境的污染主要集中表現在城市的空氣污染，尾氣中含有上百種的化合物，排放入空氣后容易形成酸雨、光化學煙霧、霧霾等現象[4]。汽車尾氣中所包含的物質主要有一氧化碳（CO）、氮氧化物（NOx）、碳氫化合物（HC）和細微顆粒物等，這些污染物對人體健康具有潛在的、長久危害，對生態環境同樣造成直接污染和破壞[5]。據統計，每千量汽車每天排出一氧化碳約3000kg，碳氫化合物質200-400kg，氮氧化合物50-150kg。一氧化碳與血紅蛋白有高度的親和力，比氧氣要大210倍以上，當空氣中一氧化碳濃度升高時，血紅蛋白與一氧化碳相結合，喪失運輸氧的能力，可危及人和動物生命。碳氫化合物中包含多種有機物成分，部分有機成分被證明是非常強的致癌物質，如苯、苯并芘等多環芳烴類物質。尾氣中的氮氧化合物含量相對較少，但毒性卻非常的大，達到一定濃度就會對人的呼吸系統和免疫功能造成嚴重危害。此外，汽車尾氣中的含鉛化合物很多，可隨呼吸進入血液，并長期蓄積在體內，引起貧血、腦損傷等癥狀，還會影響兒童正常成長和智力發育低下，甚至出現嚴重癡呆癥狀。鉛還能經由母體血液進入胎盤，危害胎兒健康。2000年開始，我國在全國范圍內推廣了無鉛汽油，解決了汽車尾氣中鉛污染的問題，但事實上，無鉛汽油仍然存在不少環境污染問題[6]。近年來，隨著霧霾等大氣污染問題的日益突出，也使得大量細顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）走進了人們的視野，細顆粒物對大氣的污染形勢十分嚴峻。

2 汽車尾氣顆粒物

汽車顆粒物污染是對人體健康危害最大的大敵。顆粒物被定義為可懸浮于空氣中的固體和液體微粒，根據粒徑大小可分為總懸浮顆粒物（粒徑≤100μm）、粗顆粒物（粒徑≤10μm，即PM10）和細顆粒物（粒徑≤2.5μm，即PM2.5，也成為可入肺顆粒物）、超細微粒（粒徑≤100 nm）等。目前國內大多數研究集中在細顆粒物對人體各器官的損害。汽車尾氣排出的顆粒物表面較粗糙且呈多空隙狀態，具有較強的吸附能力[7]。汽油燃燒過程中產生的大量有機物、未燃油和揮發性有機物等都會吸附在其上。分析結果顯示，顆粒物吸附有多種有機物，其中主要包括酸、酯、烷烴、多環芳烴類（PAHs）如芘、蒽等、雜環化合物（苯并噻唑）、含氧化合物等。無鉛汽油車尾氣排出顆粒物，顆粒物吸附的有機物所占的比例較高， 而且由于無鉛汽油中芳烴、烯烴的含量高，顆粒物也含有多種的芳烴化合物 [8]。顆粒物對人體的毒性作用取決于顆粒物的來源、濃度、粒徑、化學組成（過渡金屬、可溶性組分、有機成分、生物成分）、酸性、吸濕性、可溶性，以及與其他污染物的協同作用[9]。

在尾氣顆粒物排放上，美國是全球最早制訂排放標準的國家之一，也是汽車排放法規最嚴的國家，其中聯邦標準（EPA2010）最為嚴格，比如其規定的重卡柴油機氮氧化物和顆粒物，每制動馬力1小時的排放上限分別為 0.2 g 和 0.01 g，幾乎相當于零排放。近些年，歐洲標準的限值也是越來越嚴。日本也在很早之前就對細顆粒物的來源和危害有過很多的研究，得出汽車排放的顆粒物是城市中PM2.5的主要來源，而且粒徑相對較小的細顆粒物還具有致癌作用[10]。而我國自從細顆粒物指標加入新修訂的 GB3095-2012《環境空氣質量標準》以來，機動車細顆粒物排放才得到重視，尾氣顆粒物毒性的生物監測也成為一個研究熱點。由于采樣和檢測設備、技術和方法的缺乏，尾氣顆粒物的生成機理、檢測方法、毒性效應等還需要進一步地研究。

3 汽車尾氣顆粒物生物監測現狀

以下內容是有關不同種類的生物學監測介紹。

3.1 細胞系及酵母等監測與研究

3.1.1 人癌細胞

張遵真等[11]為研究汽車尾氣的毒性作用機制，以人肺腺癌A549細胞為研究對象，采用MMT試驗檢測汽車尾氣顆粒物對細胞的毒性作用，結果顯示出明顯的細胞毒性，且隨濃度的增加，細胞存活率也下降。

3.1.2 重組基因酵母

王娟等[12]的實驗中，采用環境雌激素基因重組酵母測評系統，測定了汽車尾氣的雌激素活性。結果表明汽車尾氣在最高劑量時吸光度值（A600）遠遠低于其他各劑量組，說明汽車尾氣超過一定濃度范圍會對酵母細胞產生毒性作用，導致酵母細胞死亡。同時，汽車尾氣在個別劑量時檢出雌激素活性，說明汽車尾氣具有微弱雌激素樣作用。此外，吳文忠等[13]用重組基因酵母檢測了污泥、土壤中的類雌激素污染物，發現樣品餾分中多環芳烴（PAHs）的含量與雌激素的活性正相關。通過研究尾氣顆粒物的組成，結合一些研究結果和參考文獻，有理由推測汽車尾氣中的雌激素樣作用可能與尾氣顆粒物中的多環芳烴類（PAHs）等物質有關。

3.2 昆蟲系統監測與研究

這是一個有趣的研究領域，高慧璟等[14]研究了道路交通污染對昆蟲的影響。其中提到，汽車尾氣中的細顆粒物飄落到公路干線兩側的植物表面，與植物組織結合后很難分解，通過食物鏈轉移到植食性昆蟲及其天敵體內，并造成嚴重威脅。根據昆蟲對污染物的反應類型進行區系分類，開展昆蟲系統調查，同時利用昆蟲對交通污染物的特異性反應，進行環境監測指示生物研究[15]。

3.3 哺乳動物監測與研究

哺乳動物的監測與研究主要是圍繞大鼠及小鼠用于汽車尾氣顆粒物毒性監測展開的。

3.3.1 呼吸系統損害

在早年，彭寶成等[16]就曾采用大鼠氣管內注入尾氣顆粒物的形式觀察生物效應。得出結論，汽車尾氣顆粒物能引起肺組織及細胞染色體損傷。近些年，顆粒物致呼吸系統的損害依然是比較常見的研究方向。肖純凌等[17]，通過制備動物模型，即SPF級Wistar大鼠氣管注入PM2.5混懸液及其他對照樣本，觀測暴露不同時期大鼠氣管和肺泡的超微結構變化。結果大鼠氣管掃描電鏡觀察可見，隨著染毒劑量的增高，氣管上皮纖毛粘連、紊亂； PM2.5對大鼠肺組織的損害比對氣管上皮的損害嚴重得多，可使肺纖維增生，肺泡腔變小，甚至使肺泡上皮細胞脫落溶解。與大鼠一樣，作為哺乳動物首先考慮尾氣對其肺部損傷的作用。唐思文等[21]選擇SPF級雄性昆明小鼠（Kunming mice，KM小鼠）作為實驗動物。隨機分組，采用自制汽車尾氣染毒柜進行短時、多次、連續染毒。通過肺組織HE染色、免疫組化法、Western印跡法等實驗方法檢測發現汽車尾氣暴露后，小鼠肺組織出現明顯病理損傷，其作用與多個炎癥因子表達增高和氧化損傷有關。

3.3.2 生殖功能損害

嚴超等[18]研究，建立Sprague Dawley（SD）大鼠汽車來源PM2.5長期暴露模型，研究PM2.5長期暴露對SD大鼠生殖功能的損傷及其機制。將足夠數量SD雄性大鼠樣本 隨機分配成 3 組： 生理鹽水對照組，低劑量組，高劑量組。連續暴露，統計雌鼠受孕率，剩余實驗鼠取材，進行精子計數和畸形率測定、睪丸組織病理學檢測以及睪丸組織蛋白表達檢測。通過實驗得出，PM2.5長期暴露損傷血睪屏障的完整性，進而破壞生精微環境的穩定，生精細胞發育異常，精子生成數量減少和質量降低，并最終導致生殖功能損傷。

3.3.3 胚胎毒性及遺傳毒性

比較特別的研究，王海青等[19]使用妊娠期Wistar大鼠，通過動式染毒裝置進行吸入染毒，觀察汽車尾氣對妊娠結局及胎鼠的影響，得出汽車尾氣具有胚胎毒性和遺傳毒性的結論。指出尾氣中的多環芳烴（PAHs）可以通過胎盤屏障，造成胎兒生長發育受限。同樣，根據葉雯婧等[20]等報道，通過對汽車尾氣顆粒物進行采樣，制備提取液。向孕鼠妊娠起經腹腔注射，按二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）對照組、低濃度組合高濃度組進行研究。結果高劑量組非存活胎鼠發生率和活胎鼠宮內發育遲緩發生率均高于對照組；高低劑量組均出現外觀畸形的活胎鼠，對照組的活胎鼠外觀正常。通過HE染色觀察到不同程度的組織病理損傷。得出汽車尾氣顆粒物可造成胎盤組織病理損傷，增加了宮內發育遲緩和外觀畸形的發生率的結論。

3.3.4 其他器官或者多器官的損害

與上述同樣的暴露方法及實驗手段，還可以研究尾氣顆粒物的多器官毒性。結果顯示，與正常組相比，PM2.5暴露組的SD大鼠體重明顯降低，且肺部外觀改變明顯，肺臟及心臟組織結 構受損，出現心肌水腫，炎癥反應明顯，肝臟、脾臟及腎臟亦有炎癥表現[22]。在小鼠，張志紅等[23]利用汽車尾氣顆粒物有機提取物進行腹腔注射染毒。測定小鼠外周血白細胞分類、體重增長和臟器重量、抗體形成細胞實驗及腹腔巨噬細胞吞噬功能實驗4個指標。結果表明，尾氣顆粒物對小鼠免疫功能有抑制作用，并且是多方面的。

4 斑馬魚在科研中的優勢

斑馬魚（Danio rerio）是一種常見的小型熱帶淡水魚。因為體側有類似斑馬一樣的條紋而得名。斑馬魚體型纖細，成魚體長約4cm，成梭形或紡錘形。它的世代時間短，3～4個月即可達到性成熟。斑馬魚常年產卵，成熟雌魚每隔幾天可產幾百枚卵。卵子體外受精、發育，胚胎發育同步且速度快，胚體透明。斑馬魚對水質要求不高，發育溫度為25～31℃。目前斑馬魚己逐漸成為最受關注的脊椎動物發育生物學模式之一，在環境毒理學、病理毒理學等方面顯示出了很大的優勢[24]。

概括來說，斑馬魚作為模式生物有以下優點：（1）成本低：由于斑馬魚體型小，所需養殖空間少，養殖成本低；能大規模養殖繁育，便于獲得大量樣本；染毒劑量少，節約實驗成本；（2）易觀察：斑馬魚胚胎透明，可以清楚地觀察到各個階段的發育情況；（3）可利用信息豐富：斑馬魚由于基因信息全面且已有多種轉基因魚模型，作為一種國際標準的動物模型而普遍應用于醫學、基因組學及生態毒理學的研究中；（4）斑馬魚胚胎敏感度高，這對環境毒理評價具有重要意義；（5）研究方法多：如整體原位雜交技術、整體免疫組化技術、熒光技術等；（6）具有遺傳毒性：斑馬魚生長周期短，有利于次代的檢測與觀察。

在我國，斑馬魚被廣泛用于胚胎發育學研究領域，一般常用動物模型如小鼠屬于胎盤動物，胚胎操作時不能離開母體，實驗分析時就需要大量推論，用時超過20天，需要大量的資金和人力。而斑馬魚的胚胎體外發育且發育非常迅速，各發育階段有其明顯的特征，易于準確地在各不同階段進行處理[25-26]。

5 斑馬魚胚胎作為尾氣顆粒物毒性監測模 型的可行性

顆粒物對人體的危害與其來源以及復雜的理化性質（如表面形態特征、吸附組分等）有著很大的關系，它對人體可能產生諸多危害，毒性機制也不唯一，因此對顆粒物的毒性需要進行高通量評價[27-28]。而斑馬魚胚胎的經濟、快速、敏感，可大面積高通量初期篩選與檢測，突出了其顯著優點。

給斑馬魚胚胎染毒所用的汽車尾氣顆粒物，使用大中流量大氣采樣裝置和稱重過的玻璃纖維濾膜進行采樣，也可采用直接刮取排氣管上積碳的方法。采樣后的濾膜進行再次稱重，記錄。浸泡于酒精或其他溶劑經超聲波震蕩萃取，過濾后提純，用二甲基亞砜（DMSO）溶劑定容，提取液4℃保存[29]。實驗動物斑馬魚胚胎，選用受精后2h的斑馬魚進行梯度染毒，因為斑馬魚胚胎及幼魚呈透明狀，因此它在形態學方面極易觀察。在光學顯微鏡下可以很直觀的看到他的發育狀況是否正常。可以通過軟骨染色觀察顆粒物提取液對斑馬魚胚胎軟骨發育的影響。也可以深入的做病理組織學及其酶類變化方面的的檢測. 還可以通過切片，以及HE染色來觀察尾氣顆粒物對斑馬魚胚胎肝臟等器官的組織學變化，通過二惡英類物質標志物質細胞色素P450 （CYP1A）的誘導期強度（如CYP1A抗體染色或者定量PCR）檢測二惡英類物質的污染程度。

綜上所述，表明斑馬魚胚胎作為汽車尾氣顆粒物毒性生物監測測模型具有實際可行性。尤其是污染物的高通量檢測，為尾氣凈化技術、污染檢測技術及污染物過濾技術提供高通量檢測。

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