補骨脂煎劑對2型糖尿病大鼠骨折愈合過程中Wnt/PPARγ信號通路影響研究

曹大寧， 陽春華， 李 聰

(湖南省長沙市第一醫院骨科， 湖南 長沙 410000)

補骨脂煎劑對2型糖尿病大鼠骨折愈合過程中Wnt/PPARγ信號通路影響研究

曹大寧， 陽春華， 李 聰

(湖南省長沙市第一醫院骨科， 湖南 長沙 410000)

目的：探討補骨脂煎劑對2型糖尿病大鼠骨折愈合過程中Wnt/PPARγ信號通路的影響。方法：選取健康雄性SD大鼠72只，隨機分為對照組、模型組、氟化鈉組以及補骨脂組，各18只。對照組建立脛骨骨折模型，其余各組采用鏈脲佐菌素腹腔注射建立2型糖尿病脛骨骨折模型，并給予相應的藥物治療。對大鼠脛骨BMD、FPG及血清Ca、P、ALP水平、脛骨彎曲強度和扭矩、骨組織β-catenin、p-GSK3β、PPARγ蛋白表達水平進行檢測。結果：治療后，與模型組比較，各組大鼠脛骨BMD水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)；各組大鼠血清Ca、P水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組(P<0.05)，各組大鼠血清ALP水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)；各組大鼠脛骨彎曲強度和扭矩水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)；各組大鼠骨組織β-catenin蛋白表達水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)，各組大鼠骨組織p-GSK3β蛋白表達水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組(P<0.05)；各組大鼠骨組織PPARγ蛋白表達水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組(P<0.05)。結論：補骨脂煎劑能夠明顯提高2型糖尿病骨折大鼠BMD、血清ALP水平，降低血清Ca、P水平，提高骨的生物力學強度，加速骨折愈合，可能與上調β-catenin蛋白表達，下調p-GSK3β、PPARγ蛋白表達，激活Wnt信號通路、抑制PPARγ信號通路有關。

補骨脂煎劑； 2型糖尿病； 大 鼠； 骨折愈合； Wnt/PPARγ信號通路

骨折愈合是骨骼重生及其原始連續性重建的復雜修復過程[1]，涉及成骨細胞、破骨細胞、骨細胞、間充質干細胞等多種細胞，同時受到年齡、內分泌因素、營養狀況、某些疾病、骨代謝調節因子、骨折局部損傷程度、血供等多種因素的影響[2]。資料顯示，由于各種原因導致骨折不愈合的發生率為2.5%～4.4%[3]，對患者生活質量和健康造成嚴重影響。2型糖尿病(T2DM)是以高血糖為特征的慢性全身代謝性疾病，近年來在我國的發病率逐年升高。T2DM除存在糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂之外，也對骨代謝產生不良影響，是導致骨折風險增加和骨折不愈合的重要原因之一[4]。目前，針對T2DM骨折不愈合尚無特效療法，控制血糖、手術、生物刺激、物理治療等常規治療方法的治愈率也較低。補骨脂是骨科臨床常用的中藥，具有補腎壯陽、補脾健胃之效，研究認為，其能夠影響成骨細胞及間充質干細胞的增殖，對于骨代謝、骨質疏松有良好的治療作用[5]，但對于T2DM骨折的治療研究較少。本研究主要探討補骨脂煎劑對2型糖尿病大鼠骨折愈合過程中Wnt/PPARγ信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 材 料

1.1.1 研究對象：選取周齡為8周的健康清潔雄性SD大鼠72只，購自上海澤生科技開發有限公司，動物許可證號：SYXK(滬)2015-0003，體重240-300g，平均體重(264.74±14.28)g。將大鼠單籠飼養，飼以普通標準飼料及消毒自來水，大鼠活動與進食自由，實驗室環境安靜、通風、陽光充足，溫度22℃左右，濕度保持在50%-70%，每周兩次更換墊料。

1.1.2 主要藥品與試劑：補骨脂，由遼寧省中醫院藥房，加水浸泡、煎煮、過濾、濃縮，制成濃度為1g/mL的水煎劑備用；氟化鈉，純度：>99%，貨號：7681-49-4，美國USP公司產品，加生理鹽水溶液制成濃度為2mg/mL的溶液；檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(1moL/L,pH4.5)，貨號：JD-7001，上海晶都生物技術有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)，純度：≥99.0%，CAS號：18883-66-4，美國Sigma公司產品，加高溫消毒后的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配置成濃度為1%，PH為4.5的溶液，即用即配；10%水合氯醛溶液，江萊生物科技有限公司；鈣(Ca)測定試劑盒(鄰甲酚酞絡合酮比色法)、磷(P)測定試劑盒(磷鉬酸鹽法)、堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(對硝本苯磷酸二鈉法)，購自寧波博泰生物技術有限公司；兔抗β連環蛋白(β-Catenin)抗體、兔磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK3β)抗體、兔過氧化酶活化增生受體γ抗體(PPAR-γ)、β-Actin抗體，北京柏奧萊博科技有限公司；Western及IP細胞裂解液(P0013)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG，碧云天生物技術研究所；ECL顯色試劑盒。

1.1.3 主要儀器設備：XR-46 雙能X線骨密度儀，美國NORLAND公司產品；ACCU-CHEK Performa血糖儀及試紙，瑞士羅氏公司(Roche)；ALLEGRA X-12離心機、AU680自動生化分析儀，美國貝克曼(Beckman)公司；CUT6062全自動石蠟切片機，德國SLEE公司產品；QX-W200生物力學測試儀，上海企想檢測儀器有限公司產品；ChemiDoc XRS化學發光成像系統，美國伯樂BIO-RAD公司； Q550CW圖象采集和分析系統，德國LEICA公司產品。

1.2 方 法

1.2.1 造模及實驗方法[6]：適應性飼養1周后，從72只大鼠中隨機抽取18只作為對照組，給予1.0moL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液50mg/kg腹腔注射，其余54只建立糖尿病模型，首先禁食24h，給予1%STZ溶液50mg/kg一次性腹腔注射，，繼續飼養，2周后，取除對照組外所有大鼠的空腹尾靜脈血，檢測空腹血糖(FPG)≥7.0mmoL/L即為2型糖尿病模型建立成功，此次所有大鼠造模成功；成模后，采用隨機數字表法將大鼠簡單隨機分為模型組、氟化鈉組以及補骨脂組，每組18只。各組大鼠均給予10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射進行麻醉，固定于手術架上，左下肢脛骨部常規備皮、消毒、鋪巾，逐層切開皮膚、分離肌肉，顯露左脛骨，采用線鋸鋸斷左脛骨上段，造成骨折，沖洗、縫合傷口，外用復位夾板固定，建立大鼠骨折模型；術后第2d，氟化鈉組給予2mg/mL氟化鈉溶液10mL/kg，1次/d灌胃；補骨脂組給予1g/mL的補骨脂煎劑10mL/kg，1次/d灌胃；模型組及對照組分別給予等量生理鹽水，1次/d灌胃；兩組大鼠連續給藥6周。

1.2.2 骨密度測定：最后一次給藥后，禁食12h，給予10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定于檢查臺，采用雙能X線骨密度儀檢測各組大鼠脛骨的骨密度值(BMD)。

1.2.3 標本采集：骨密度檢測結束后，切開頸部，自頸總動脈采血，首先測量血糖，然后將采集的血液靜置4h，離心機3000r/min離心10min，分離血清，置于-80℃冰箱保存備用；處死大鼠，切開皮膚及肌肉組織，完整取出大鼠左側脛骨干，進行生物力學強度檢測，之后取骨折斷端組織，置于-80℃冰箱保存，用于Western blot及RT-PCR檢測。

1.2.4 血液指標檢測：采用血糖儀檢測各組大鼠FPG水平，采用AU680自動生化分析儀，按照鈣(Ca)測定試劑盒(鄰甲酚酞絡合酮比色法)、磷(P)測定試劑盒(磷鉬酸鹽法)、堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(對硝本苯磷酸二鈉法)說明書進行操作。測定血清Ca、P、ALP水平。

1.2.5 生物力學強度測定：取大鼠左側脛骨干，清理后生理鹽水浸透，將其兩端固定，采用QX-W200生物力學測試儀檢測各組大鼠脛骨的彎曲強度和扭矩。

1.2.6 Western blot法檢測骨組織β-catenin、p-GSK3β、PPARγ蛋白表達水平：取出凍存的骨組織，置于勻漿器內，添加200μL細胞裂解液，4℃環境充分裂解細胞，12000轉/min離心20min，棄上清得到蛋白樣品，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白含量；目的蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白，并將其轉移至PVDF膜上，室溫封閉后分別滴加β-catenin抗體(1:2000稀釋)、p-GSK3β抗體(1:1000稀釋)、PPARγ抗體(1:1000稀釋)，β-Actin抗體(1:1000稀釋)作為內參，37℃孵育1h后，洗膜，滴加HRP標記山羊抗兔IgG(1:2000稀釋)二抗，37℃孵育1h后，洗膜，在暗室內采用ECL顯色試劑盒顯影、定影，采用化學發光成像系統進行拍照，并分析圖像灰度值，觀察β-catenin、p-GSK3β、PPARγ蛋白表達水平。

1.3 統計學分析：所有統計數據均統一整理，采用SPSS17.0軟件包分析，符合正態性的計量資料采用均數±標準差表示，大鼠脛骨BMD、FPG及血清Ca、P、ALP水平、脛骨彎曲強度和扭矩、骨組織β-catenin、p-GSK3β、PPARγ蛋白表達水平除對照組外各組間比較采用單因素方差分析以及LSD多重比較，模型組與對照組比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05存在統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠脛骨BMD水平比較：與對照組比較，模型組大鼠脛骨BMD水平均較低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，氟化鈉組、補骨脂組大鼠脛骨BMD水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠脛骨BMD水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氟化鈉組比較，△P<0.05

2.2 各組大鼠FPG及血清Ca、P、ALP水平比較：與對照組比較，模型組大鼠FPG及血清Ca、P水平較高，模型組大鼠血清ALP水平較低，氟化鈉組、補骨脂組大鼠血清ALP水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，氟化鈉組、補骨脂組大鼠血清Ca、P水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組(P<0.05)，氟化鈉組、補骨脂組大鼠血清ALP水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組，差異具有統計學意義(P<0.05)見表2。

2.3 各組大鼠脛骨彎曲強度和扭矩比較：與對照組比較，模型組大鼠脛骨彎曲強度和扭矩水平較低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，氟化鈉組、補骨脂組大鼠脛骨彎曲強度和扭矩水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4 各組大鼠骨組織β-catenin、p-GSK3β蛋白表達水平比較：與對照組比較，模型組大鼠骨組織β-catenin蛋白表達水平降低，p-GSK3β蛋白表達水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，氟化鈉組、補骨脂組大鼠骨組織β-catenin蛋白表達水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)，氟化鈉組、補骨脂組大鼠骨組織p-GSK3β蛋白表達水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4，圖1。

表2 各組大鼠FPG及血清Ca、P、ALP水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氟化鈉組比較，△P<0.05

表3 各組大鼠脛骨彎曲強度和扭矩比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氟化鈉組比較，△P<0.05

表4 各組大鼠骨組織β-cateninp-GSK3β蛋白表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氟化鈉組比較，△P<0.05

2.5 各組大鼠骨組織PPARγ蛋白表達水平比較：與對照組比較，模型組大鼠骨組織，PPARγ蛋白表達水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，氟化鈉組、補骨脂組大鼠骨組織PPARγβ蛋白表達水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表5,圖2。

圖1 各組大鼠骨組織β-catenin、p-GSK3β蛋白表達情況

圖2 各組大鼠骨組織PPARγ蛋白表達情況

表5 各組大鼠骨組織PPARγ蛋白表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氟化鈉組比較，△P<0.05

3 討 論

骨折愈合包括細胞遷移、血管生成、骨痂改建等過程[7]，此過程由多種細胞和因子參與完成，任何方面受到影響都可能造成骨折不愈合。T2DM是重要的內分泌系統疾病，長期代謝紊亂能夠造成多系統損傷，也能從多個方面對骨折愈合過程產生影響，一方面，T2DM能夠造成骨量流失影響愈合[8]；另一方面，T2DM多伴有血管病變，影響骨折端血供，高糖狀態也造成細胞活性降低、膠原合成異常[9]，骨形成速度及強度下降；此外，T2DM還對胰島素生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、骨形態蛋白等有調控作用，妨礙骨折愈合。T2DM造成的骨折愈合障礙成因復雜，在治療上較為困難。中醫認為，T2DM合并骨折屬于“消渴”“骨折”“骨萎”范疇，與脾、腎虧虛關系密切，治療上應健脾益腎，強筋健骨。補骨脂也稱破故紙、婆固脂等，有溫腎壯陽、補脾健胃之效，常用于中藥復方中治療骨科疾病。現代藥理研究發現，補骨脂含有黃酮類、香豆素類、豆甾醇等多種活性成分[10]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗白癜風、調節免疫等作用，還能通過影響成骨細胞增殖、分化，誘導骨髓間充質干細胞分化成成骨細胞，調節骨形成和骨吸收以及雌激素樣作用防治骨質疏松。本次研究選取健康雄性SD大鼠，采用STZ腹腔注射法建立T2DM大鼠模型，并造成骨折，來探討補骨脂煎劑對T2DM大鼠骨折愈合的影響以及分子機制本研究結果顯示，與模型組比較，各組大鼠脛骨BMD水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)；各組大鼠脛骨彎曲強度和扭矩水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)，BMD是影響骨的生物學強度的主要因素，骨折愈合的質量與其生物學強度密切相關，研究結果表明補骨脂煎劑能夠有效提高骨密度，改善骨折愈合質量。

T2DM的高血糖狀態形成高滲性利尿作用，能夠使體內Ca、P流失，一方面骨合成原料減少，另一方面能刺激甲狀旁腺激素分泌，骨吸收作用增強，骨折愈合緩慢，血清Ca、P水平升高。本研究結果顯示，各組大鼠血清Ca、P水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組(P<0.05)，表明補骨脂煎劑能夠抑制骨吸收作用，降低血清Ca、P水平；骨代謝的基本過程是骨形成和骨吸收，只有骨形成作用強于骨吸收，骨折才能順利愈合，而骨形成過程與成骨細胞活性關系密切，ALP由成骨細胞分泌，能夠促進骨的鈣化，也是成骨細胞分化的早期標志，能夠反映骨形成能力。本研究結果顯示，各組大鼠血清ALP水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)，表明補骨脂煎劑能夠提高骨形成能力，促進骨折愈合。

Wnt 信號通路和PPARγ信號通路均是調節骨代謝的重要途徑，能夠調控成骨細胞及破骨細胞的增殖、存亡。β-catenin蛋白、p-GSK3β蛋白是Wnt 信號通路的重要組分，Wnt 信號通路激活，則β-catenin蛋白與細胞因子/淋巴增強因子轉錄因子結合形成復合體，從而激活成骨基因轉錄，促進細胞向成骨細胞分化，有利于骨折愈合；Wnt 信號缺失，p-GSK3β能夠誘導β-catenin蛋白降解，導致細胞內β-catenin蛋白水平降低，成骨細胞分化受到抑制。PPARγ蛋白是一種核激素受體，能夠通過抑制成骨細胞特異轉錄因子表達來成骨細胞分化、抑制骨鈣素基因表達、促進破骨細胞發育等，從而造成骨吸收增加，造成骨折愈合障礙。另外，Wnt 信號通路和PPARγ信號通路具有相互影響、相互制約的作用。本研究結果顯示，各組大鼠骨組織β-catenin蛋白表達水平較高，且補骨脂組>氟化鈉組(P<0.05)，各組大鼠骨組織p-GSK3β蛋白表達水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組(P<0.05)；各組大鼠骨組織PPARγ蛋白表達水平較低，且補骨脂組<氟化鈉組(P<0.05)，表明補骨脂煎劑能夠通過激活Wnt信號通路、抑制PPARγ信號通路發揮促進骨折愈合的作用。

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Study on the Effect of Buguzhi Decoction on Wnt/PPARγ Signal Pathway in Healing Process of Fracture in Type 2 Diabetic Rats

CAODaning,YANGChunhua,LICong

(TheFirstHospitalofChangsha,HunanChangsha410000,China)

Objective:To analysis the effect of Buguzhi Decoction on Wnt/PPARγ signal pathway in healing process of fracture in type 2 diabetic rats. Methods: Seventy-two healthy male SD rats were randomly divided into control group, model group, sodium fluoride and Buguzhi group, each with 18 rats. The tibial fracture model was established in control group, type 2 diabetic tibial fracture model were established by intraperitoneal injection of streptozotocin in the other groups, and were given corresponding drug treatment. The tibia BMD, FPG and serum Ca、P、ALP levels, tibia bending strength and torque, the expression levels of β-catenin, p-GSK3β and PPARγ in bone tissue were detected. Results: After treatment, compared with model control group, the tibia BMD levels were higher in rats of each group，and Buguzhi group was higher than sodium fluoride group(P<0.05)；the serum Ca、P levels were lower in rats of each group，and Buguzhi group was lower than sodium fluoride group (P<0.05)；the serum ALP levels were higher in rats of each group，and Buguzhi group was higher than sodium fluoride group (P<0.05)；the tibia bending strength and torque levels were higher in rats of each group，and Buguzhi group was higher than sodium fluoride group (P<0.05)；the expression of β-catenin protein in bone tissue of rats in each group was higher in rats of each group, and Buguzhi group was higher than sodium fluoride group (P<0.05)；the expression of p-GSK3β protein in bone tissue of rats in each group was lower in rats of each group, and Buguzhi group was lower than sodium fluoride group (P<0.05)；the expression of PPARγ protein in bone tissue of rats in each group was lower in rats of each group, and Buguzhi group was lower than sodium fluoride group (P<0.05). Conclusions: Buguzhi Decoction can effectively improve the BMD、serum ALP levels of fracture and type 2 diabetic rats, reduce serum Ca、P levels, improve the biomechanical strength of bone, accelerate fracture healing, it may be associated with up regulation ofβ-catenin protein expression, down regulation of p-GSK3β、PPARγ protein expression, activation of the Wnt signaling pathway and inhibition of the PPAR signaling pathway.

Buguzhi decoction; Type 2 diabetes; Rat; Fracture healing; Wnt/PPAR signal pathway

1006-6233(2017)04-0651-06

湖南省2013年科技基本建設項目投資計劃，(編號：2013HS02356)

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.04.035