TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在膽囊癌組織中的表達及臨床意義

李新星， 滕世峰， 徐 楷， 張言言， 張衛剛， 張憲文， 姚 駿， 姚厚山， 黃 歆， 胡志前

(第二軍醫大學附屬長征醫院 普外一科， 上海 200030)

TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在膽囊癌組織中的表達及臨床意義

李新星， 滕世峰， 徐 楷， 張言言， 張衛剛， 張憲文， 姚 駿， 姚厚山， 黃 歆， 胡志前

(第二軍醫大學附屬長征醫院 普外一科， 上海 200030)

目的 探討膽囊癌組織中人滋養層細胞表面抗原(TROP)2、磷酸化細胞外信號調節激酶 (p-ERK)1/2和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表達及其與臨床病理參數之間的關系，并分析其與膽囊癌患者預后的關系。方法 搜集第二軍醫大學附屬長征醫院2005年6月-2010年6月確診并獲取病理標本的膽囊癌患者88例，采用免疫組化法檢測88例膽囊癌組織及15例癌旁組織中 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表達。計數資料采用χ2檢驗，Spearman檢驗法分析TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1間相關性；單因素和多因素Cox回歸分析膽囊癌患者預后的影響因素；Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線。結果 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在膽囊癌組織中的陽性表達率分別為74.30%、58.40%和55.30%，明顯高于癌旁組織中的表達(5.42%、35.67%和39.87%)(P值均<0.05)。TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表達與膽囊結石、腫瘤直徑、分化程度、血管神經侵犯、淋巴結轉移、手術方式及TNM分期相關(χ2=4.300～53.315，P值均<0.05)。TROP2與p-ERK1/2、Cyclin D1的表達呈正相關(rs值分別為0.402、0.742，P值均<0.001)，且p-ERK1/2與Cyclin D1的表達也呈正相關(rs=0.242，P=0.023)。多因素生存分析提示，TROP2的陽性表達是患者3年生存率的獨立危險因素(相對危險度=2.412，95%可信區間：1.186～5.126,P=0.010)。結論 TROP2的高表達可能是膽囊癌惡性進展的重要原因，高表達的TROP2可能介導p-ERK1/2和Cyclin D1的高表達，導致膽囊癌惡性進展。TROP2是判斷膽囊癌患者預后的獨立危險因素，有可能是臨床干預的有效靶點。

膽囊腫瘤； 人滋養層細胞表面抗原2； 磷酸化細胞外信號調節激酶1/2； 細胞周期蛋白D1； 預后

膽囊癌是最常見的膽道系統腫瘤，其早期診斷困難，惡性程度高，預后差[1]。文獻[2-3]報道，膽囊癌患者5年生存率不足5%，早期診斷困難及惡性進展是其生存期短的主要原因。目前，膽囊癌的主要治療方式仍以手術為主，輔助放化療，但治療效果不理想。因此尋找膽囊癌發生發展的相關分子靶點，改善膽囊癌患者的預后是亟待解決的臨床問題。

細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)是絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路的亞家族，磷酸化的ERK(phosphorylated extracellular signal regulated kinase，p-ERK)1/2是ERK的活化形式，可介導信號由胞漿向胞核傳遞，激活下游細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)等，參與腫瘤的增殖和轉移。人滋養層細胞表面抗原(human trophoblast cell-surface antigen，TROP)2是一種單次跨膜表面糖蛋白，其名源于它在胚胎滋養層細胞和絨毛膜癌中的高表達，研究[4-6]證實TROP2在許多實體腫瘤中高表達，而在正常上皮或癌旁組織中低表達或不表達，參與多種腫瘤的惡性進展。文獻[7]報道，在宮頸癌中TROP2通過ERK信號通路調節Cyclin D1蛋白的表達，進而促進宮頸癌細胞的增殖和轉移。但在膽囊癌中未有研究報道。

因此，本研究通過檢測 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在膽囊癌組織切片中的表達情況，并分析各種蛋白表達的關系及臨床意義，探討TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在膽囊癌惡性進展中可能的作用機制，為臨床靶向干預提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集本院2005年6月-2010年6月收治的膽囊癌患者，手術切除后病理證實為膽囊癌的腫瘤組織標本，所有患者均有完整的臨床、病理及隨訪資料。入選標準：(1)經病理細胞學或組織學確診的膽囊癌；(2)既往無第二或有第二腫瘤但已生存5年以上；(3)既往未行放化療等新輔助治療；(4)無活動性心臟病、無慢性活動性出血性疾病、近期無急性失血、無明顯腎損傷、無血液系統疾病且造血功能正常；(5)2個月內無輸血、未曾接受促紅細胞治療；(6)年齡≥18周歲；(7)有確切隨訪時間，且≥1個月。

1.2 免疫組化染色和判斷標準

1.2.1 主要試劑和方法 山羊抗人TROP2單克隆抗體購自美國R&D公司，小鼠抗人p-ERK1/2和Cyclin D1單克隆抗體購自英國Abcam公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。采用免疫組化三步法，按試劑盒說明進行操作，用PBS代替一抗作為陰性對照。用已知陽性的腫瘤標本作為陽性對照。

1.2.2 主要步驟 標本經10%甲醛溶液固定后石蠟包埋，制備厚度約4 μm厚的組織切片。二甲苯脫蠟15 min×3次，依次用90%、85%、75%、70%梯度的乙醇浸片，每次5 min；3%的H2O2/甲醇溶液浸泡10 min，以消除內源性過氧化物酶的影響，0.125%的EDTA胰蛋白酶抗修復液修復30 min，胎牛血清封閉30 min后，加一抗4 ℃孵育過夜。次日加標有生物素的二抗(兔抗小鼠/山羊)30 min，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素染色、脫水、透明、中性樹膠封固。

1.2.3 結果判定 TROP2主要在細胞膜表達，部分在胞質表達，TROP2的蛋白表達評判主要依據Fong等[8]的標準，以染色比例和染色強度的乘積計算，總分為0～12分，其中≥4被認為是高表達。染色比例評分為：0，0分；<10%，1分；10%～50%，2分；51%～80%，3分；>80%，4分。染色強度評分為：無色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。p-ERK1/2陽性表達為細胞核或細胞質出現黃色或棕黃色顆粒，Cyclin D1蛋白表達主要定位于胞核。選取10個高倍視野計數陽性細胞，按照Beeskey分級方法：以陽性細胞所占百分比并參考著色強度分級如下：無陽性細胞或陽性細胞數<10%為陰性，陽性細胞數≥10%為陽性。由病理科醫師連續讀片。其中臨床參數淋巴結轉移有無分期依據Shu等[9]文獻報道，腫瘤直徑3 cm為界點分組依據Liu等[10]文獻報道。

1.3 隨訪 所有患者術后均進行定期隨訪，隨訪的內容為患者存活情況及生存質量，隨訪開始時間為患者接受手術的時間，截止日期為2014年12月31日，以患者死亡或末次隨訪日期為截點確定生存時間，隨訪時間中位數為36.75個月。采用門診隨訪和電話隨訪相結合的方式，平均每3個月隨訪1次。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用等級相關的Spearman法檢驗。單因素和多因素Cox回歸分析膽囊癌患者預后的影響因素；Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 共收集腫瘤組織標本88例，其中R0根治性手術切除72例，R1姑息性手術切除16例。收集膽囊癌旁新鮮組織共15例。88例患者中，男21例，女67例，平均60.28歲，伴結石者39例。腫瘤高分化24例，中分化30例，低分化34例。依據美國癌癥聯合研究會(ATCC)分期標準，Ⅰ/Ⅱ期52例，Ⅲ/Ⅳ期36例，伴有血管神經侵犯34例。手術患者均恢復良好，出院后有無繼續選擇放化療、免疫治療、靶向治療等信息未予以采集。

2.2 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在膽囊癌及癌旁組織中的表達情況 TROP2蛋白主要定位于細胞膜，隨著分化程度的降低，部分表達于胞質，p-ERK1/2陽性表達為細胞核或細胞質出現黃色或棕黃色顆粒，Cyclin D1蛋白表達主要定位于胞核(圖1)。TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在膽囊癌組織中的陽性表達率分別為74.30%、58.40%和55.30%，與癌旁組織中的表達比較(5.42%、35.67%和39.87%)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

2.3 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表達與膽囊癌臨床病理特征的關系 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表達與膽囊癌患者的性別、年齡均無關(P值均>0.05)。伴有膽囊結石、腫瘤直徑≥3 cm或有血管神經侵犯患者的癌組織中3種蛋白的表達，與無膽囊結石、腫瘤直徑<3 cm或無血管神經侵犯患者相比，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。R1姑息性手術組與R0根治性手術組比較，膽囊癌組織中3種蛋白的表達差異有統計學意義(P<0.05)。分化程度低、存在淋巴結轉移或TNM Ⅲ/Ⅳ期患者的癌組織中3種蛋白的表達，與高/中分化、無淋巴結轉移或TNM I/Ⅱ期患者相比，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

2.4 膽囊癌組織中TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白表達的相關性分析 TROP2與p-ERK1/2、Cyclin D1的表達呈正相關(rs值分別為0.402、0.742，P值均<0.001)，且p-ERK1/2與Cyclin D1的表達也呈正相關(rs=0.242，P=0.023)。

2.5 單因素和多因素分析膽囊癌患者生存預后的影響因素 單因素生存分析顯示，TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表達影響膽囊癌患者的3年生存率(P值均<0.05)；多因素Cox回歸分析顯示，TROP2陽性表達是膽囊癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)(表2，圖2)。

表1 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1與臨床病理參數的關系(例)

表2 單因素和多因素分析膽囊癌患者3年生存率的影響因素

圖2 高表達TROP2患者的K-M生存曲線

3 討論

TROP2是上皮細胞膜表面糖蛋白受體，作為細胞內鈣信號的跨膜轉導子，TROP2在正常組織中無表達或表達很低，而在許多惡性腫瘤癌中高表達，例如胃癌[11]、胰腺癌[8]、肺癌[12]等。Fong等[13]發現，在口腔癌組織中TROP2的表達與組織分化、浸潤深度等密切相關，且隨著TROP2表達升高，總體存活率下降。TROP2在咽喉鱗狀上皮細胞癌組織中的表達與組織分化程度和淋巴結轉移相關，TROP2是咽喉癌患者生存預后的獨立預測因子[14]。Chen等[6]也報道，TROP2表達與部分膽囊癌臨床參數相關。但與其報道不同的是，在納入膽囊結石、腫瘤直徑兩個因素后，筆者發現伴有膽囊結石、腫瘤直徑≥3 cm的患者TROP2的表達更高，且具有更差的預后[15]。這可能是因為膽囊結石作為一種長期刺激因素，造成膽囊內膜的炎癥反應，導致內膜細胞異常增殖、發生癌變甚至促進轉移浸潤。而腫瘤直徑≥3 cm具有更強的浸潤能力，促進癌癥進展。此外，筆者也進一步證實，淋巴結轉移、TNM分期和TROP2表達是膽囊癌患者預后的獨立危險因素，或許靶向干預TROP2可成為臨床上治療腫瘤的一種方式。

迄今，對于TROP2參與膽囊癌惡性進展可能的機制未見報道。有研究[16]結果顯示，TROP2的表達上調激活Cyclin D1和ERK/MEK通路從而增強CREBI、e-Jun、NF-KB、Rb、STATl和STA33的表達，提示TROP2可能通過激活下游信號通路，導致腫瘤的惡性增殖和轉移，是癌癥患者生存期短的重要原因。Cyclin D1已被報道與膽囊癌細胞周期增殖相關，但p-ERK1/2在膽囊癌中的表達未見報道[17-18]。本研究發現，p-ERK1/2蛋白在膽囊癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織，且伴有膽囊結石、腫瘤直徑≥3 cm或有血管神經侵犯患者的膽囊癌組織中p-ERK1/2蛋白的表達更高。隨著分化程度越低、淋巴結轉移或TNM分期越高，p-ERK1/2蛋白的表達均更高。筆者還發現，TROP2與p-ERK1/2、Cyclin D1的表達呈正相關，且p-ERK1/2與Cyclin D1也呈正相關。生存分析顯示，膽囊癌患者的3年生存率與TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表達均相關，提示高表達的TROP2可能介導p-ERK1/2和Cyclin D1的高表達，導致膽囊癌惡性進展，影響生存率。這為進一步從細胞和動物模型水平深入研究其可能的機制提供了理論依據，也是筆者進一步需要探討的課題。

本研究尚存在幾點不足：(1)本研究缺乏膽囊癌患者術后化療、免疫治療、靶向治療等信息，而這些信息可能影響膽囊癌患者的生存；(2)本研究未納入其他病理類型的膽囊癌組織，如鱗癌、鱗腺癌、未分化癌等，不同類型來源的膽囊癌患者的生存情況是不一樣的；(3)本研究不是大數據、多中心研究來源組織，結果需要進一步驗證，甚至需要機制實驗進一步探索。

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引證本文：LI XX, TENG SF, XU K, et al. Expression of trophoblast cell-surface antigen 2, phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2, and cyclin D1 in gallbladder carcinoma tissue and related clinical significance[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 909-914. (in Chinese) 李新星， 滕世峰， 徐楷， 等. TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在膽囊癌組織中的表達及臨床意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(5): 909-914.

(本文編輯：朱 晶)

Expression of trophoblast cell-surface antigen 2, phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2, and cyclin D1 in gallbladder carcinoma tissue and related clinical significance

LIXinxing,TENGShifeng,XUKai,etal.

(FirstDepartmentofGeneralSurgery,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200030,China)

Objective To investigate the expression of human trophoblast cell-surface antigen 2 (TROP2), phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2), and cyclin D1 in gallbladder carcinoma tissue and their correlation with clinicopathological parameters, as well as their association with the prognosis of patients with gallbladder carcinoma. Methods A total of 88 patients who were diagnosed with gallbladder carcinoma in Changzheng Hospital, Second Military Medical University, from June 2005 to June 2010 were enrolled, and their pathological specimens were obtained. Immunohistochemistry was used to measure the expression of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1 in 88 gallbladder carcinoma tissue samples and 15 adjacent tissue samples. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups, and the Spearman method was used to investigate the correlation between any two parameters of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1; univariate and multivariate Cox regression analyses were used to analyze the influencing factors for the prognosis of patients with gallbladder carcinoma; the Kaplan-Meier method was used to plot their survival curves. Results The positive rates of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1 in gallbladder cancer tissue were 74.30%, 58.40%, and 55.30%, respectively, significantly higher than those in adjacent tissue (5.42%, 35.67% and 39.87%, respectively) (P<0.05). The expression of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1 was associated with gallstones, tumor diameter, degree of tumor differentiation, vascular and perineural invasion, lymph node metastasis, surgical procedure, and TNM stage (χ2=4.300～53.315, allP<0.05). The expression of TROP2 was positively correlated with that of p-ERK1/2 and cyclin D1 (rs=0.402 and 0.742, bothP<0.001), and the expression of p-ERK1/2 was also positively correlated with that of cyclin D1 (rs=0.242,P=0.023). The multivariate survival analysis showed that positive expression of TROP2 had a significant influence on 3-year survival rate (RR=2.412,95%CI:1.186～5.126,P=0.010). Conclusion High expression of TROP2 may be an important reason for malignant progression of gallbladder carcinoma, and highly expressed TROP2 may mediate the high expression of p-ERK1/2 and cyclin D1, resulting in the malignant progression of gallbladder carcinoma. Positive expression of TROP2 is an independent risk factor for the prognosis of patients with gallbladder carcinoma and may be an effective target for clinical intervention.

gallbladder neoplasms；human trophoblast cell-surface antigen 2；phosphorylated extracellular signal regulated kinase 1/2；cyclin D1；prognosis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.024

2016-11-03；

2017-01-08。

國家青年科學基金資助(8140101730)

李新星(1986-)，男，主治醫師，主要研究肝膽胰腫瘤的發生機制。

胡志前，電子信箱：huzhiq163@163.com。

R735.8

A

1001-5256(2017)05-0909-06