建立良參胃安片質量控制方法的研究

朱燕，曹恩惠，李明春

建立良參胃安片質量控制方法的研究

朱燕，曹恩惠，李明春＊

目的建立完善的良參胃安片質量控制方法。方法采用顯微鏡對制劑中以原粉入藥藥味吳茱萸、姜半夏進行顯微鑒別；采用薄層色譜方法（TLC）對制劑中所含主要成分黃芩、延胡索、香附、烏藥、丹參、郁金進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對制劑中黃芩苷進行含量測定：Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-0.2%磷酸溶液（43∶57）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μl，理論塔板數按黃芩苷峰計算應不低于2500。結果顯微鑒別中，各供試品的顯微特征與相應藥味相符；在薄層色譜中，各供試品色譜與對照藥材或對照品相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾；黃芩苷在10.42～104.2 μg/ml范圍內有良好的線性關系。結論該方法操作簡單，重復性好，能夠有效地控制良參胃安片的質量。

良參胃安片；質量標準；黃芩苷；高效液相色譜法；薄層鑒別

良參胃安片收載于《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》（2002年版），該制劑是由姜半夏、枳實、吳茱萸（炒）、香附、烏藥、土茯苓、高良姜、郁金、兒茶、丹參、百合、延胡索、黃芩13味藥材制成，具有溫中散寒、理氣活血、疏肝和胃的功效；用于慢性胃炎、消化性潰瘍等癥。為提高質量標準，本文在原標準的基礎上增加鑒別項的同時盡量替換掉原質量標準中的易制毒試劑，以減少對環境的污染和對操作人員的毒害；增加原粉入藥藥味的顯微鑒別和主要藥味的含量測定項，最終達到檢測方法簡便、快速、準確、低毒的目的，為制劑質量的安全性和有效性提供更有力的監督和保障。

1 材料

1.1 儀器電熱恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；KDM型可調控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風箱（上海申賢恒溫設備廠）；紫外分析儀WD-9340C型（北京六一儀器廠）；超聲波儀SY2200-T（上海聲源超聲儀器設備有限公司）；PH100-DB500U型攝影顯微鏡（鳳凰光學集團有限公司）；安捷倫1260高效液相色譜儀；硅膠G薄層板、硅膠GF254板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥黃芩苷對照品（批號110715-201318；含量93.3%；20 mg）、延胡索乙素對照品（批號110726-201515，含量96.9%，20 mg）、辛弗林對照品（批號110727-201107；含量99.4%；20 mg）、黃芩對照藥材（批號120955-201309）、延胡索對照藥材（批號120928-201208）、烏藥對照藥材（批號121096-201405）、香附對照藥材（批號121059-201407）、丹參對照藥材（批號120923-201414）、郁金對照藥材（批號120949-201407），購于中國食品藥品檢定研究院；良參胃安片樣品（海軍401醫院）；陰性樣品均為本院自制；10%水合氯醛；甲醇（天津四友，一級色譜純）；水為自制蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

2.1.1 吳茱萸的顯微鑒別取本品10片，研細粉，水合氯醛透化裝片，置顯微鏡下觀察可見：網紋導管，環紋導管或螺紋導管；油室碎片及油滴；非腺毛較多；螺紋導管和草酸鈣簇晶；纖維狀內果皮細胞，有時上下層交錯，或分化成短纖維狀細胞；腺毛頭部近橢圓形，含黃棕色分泌物；果皮組織或花絲細胞含橙皮苷結晶；黏液細胞類圓形或長圓形。結果見圖1。

2.1.2 姜半夏的顯微鑒別取本品10片，研細粉，水合氯醛透化裝片，置顯微鏡下觀察可見：糊化的淀粉粒團塊；針晶束；螺紋導管。結果見圖2。

圖1 吳茱萸的顯微鑒別圖

圖2 姜半夏顯微鑒別圖

2.2 定性鑒別

2.2.1 黃芩的薄層鑒別［1-4］取本品研細稱取3 g，加甲醇10 ml，超聲15 min，濾過，揮干，殘渣加30 ml水溶解，加稀鹽酸調pH值到1～2，用乙酸乙酯提取2次，10 ml/次，合并提取液蒸干，加1 ml甲醇使溶解，制成供試品溶液。另取黃芩對照藥材1 g同法制得對照藥材溶液。再取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺黃芩的陰性對照樣品3 g，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述4種溶液在同一硅膠G薄層色譜板上上樣，以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水=5∶3∶1∶1為展開劑，展開完畢后取出薄層色譜板，晾干，均勻噴以FeCl3-乙醇溶液加熱至約105℃顯色。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖3（a）。

2.2.2 延胡索的薄層鑒別［5-7］取本品研細稱取3 g，加甲醇50 ml，超聲30 min，濾過，濾揮干，殘渣加10 ml水溶解，再加氨水調溶液pH值至堿性后用10 ml乙酸乙酯萃取，重復3次，合并乙酸乙酯提取液，揮干，殘渣加1 ml甲醇溶解，制成供試品溶液。取延胡索對照藥材1 g，同法制得延胡索對照藥材溶液。取缺少延胡索藥材的陰性對照樣品3 g，同法制得延胡索陰性對照溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述3種溶液在同一硅膠G薄層色譜板上上樣，以石油醚∶丙酮=3∶1溶液為展開劑（其中石油醚60～90℃），展開完畢后取出薄層色譜板，晾干后置碘缸中，3 min后取出薄層色譜板待吸附碘揮盡，在紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖3（b）。

2.2.3 香附的薄層鑒別［8-10］取本品研細稱取3 g，加甲醇30 ml，超聲30 min，濾過，揮干，殘渣加1 ml甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取香附對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。稱取缺少香附藥材的陰性對照樣品3 g，同法制得陰性對照溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述3種溶液在同一硅膠G254薄層色譜板上上樣，以二氯甲烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸=80∶3∶1溶液為展開劑，展開完畢后取出薄層色譜板，晾干后置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖3（c）。

2.2.4 烏藥的薄層鑒別［11-13］取本品研細稱取3 g，加甲醇20 ml，超聲10 min，濾過，揮干，殘渣加1 ml乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。取烏藥對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。取缺少烏藥藥材的陰性對照樣品3 g，同法制得陰性對照溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述3種溶液在同一硅膠G薄層色譜板上上樣，以環己烷∶乙酸乙酯=5∶1溶液為展開劑，展開完全后取出薄層色譜板，晾干，均勻噴以5%香草醛硫酸溶液微熱至顯色。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖3（d）（注意樣品溶液需新鮮配制使用）。

2.2.5 丹參的薄層鑒別［14，15］取本品研細稱取3 g，加水10 ml，離心后取其上層清液加稀鹽酸溶液調溶液pH值到2，再加乙酸乙酯20 ml萃取，待萃取完全后取乙酸乙酯層水浴蒸干，殘渣加1 ml甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取丹參對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。稱取缺少丹參藥材的陰性對照樣品3 g，同法制得陰性對照溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述3種溶液在同一硅膠G薄層色譜板上上樣，以二氯甲烷∶丙酮∶甲酸=25∶10∶4溶液為展開劑，展開完全后取出薄層色譜板，晾干后用氨氣熏約5 min，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖3（e）。

2.2.6 郁金的薄層鑒別［16，17］取本品研細稱取3 g，加入無水乙醇25 ml，超聲30 min，濾過，揮干，殘渣加無水乙醇1 ml溶解，作為供試品溶液。稱取郁金對照藥材1.5 g，同法制得對照藥材溶液。稱取缺郁金的陰性對照樣品3 g，同法制得陰性對照溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述3種溶液，分別在同一硅膠G薄層板上上樣，以二氯甲烷-甲醇-醋酸=9∶1∶0.1溶液為展開劑，展開完全后取出，晾干，噴以10%磷鉬酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖3（f）。

圖36 種成分的博層鑒別圖

2.3 黃芩苷的含量測定

2.3.1 色譜條件系統適應性試驗［1，18-20］高效液相色譜儀：Agilent 1260；DAD檢測器；四元泵；色譜柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（43∶57）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。理論塔板數按黃芩苷峰計算應不低于2500。

2.3.2 溶液的制備（1）對照品溶液制備。精密稱取黃芩苷對照品11.17 mg，加70%甲醇溶解并定容，搖勻即得黃芩苷對照品貯備液（208.4 μg/ml）。依次精密吸取對照品貯備液（208.4 μg/ml）0.5、1.0、2.0、2.5、3.5、4.0、5.0 ml，分別放置帶有標記的10 ml容量瓶中并用70%甲醇稀釋至刻度，所得濃度分別為10.42、20.84、41.68、52.10、72.94、83.36、104.2 μg/ ml的1～7號系列黃芩苷對照品溶液。（2）供試品溶液制備。精密稱取良參胃安片粉末0.3 g，精密加入70%甲醇50 ml，稱重，超聲處理（功率100 W，頻率50 Hz）30 min，放冷，加入70%甲醇補足重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液即為供試品溶液。（3）陰性對照溶液制備。取缺黃芩的陰性樣品0.3 g，按照供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。

2.3.3 專屬性試驗取“2.3.2”項下對照品溶液、良參胃安片供試品溶液、缺黃芩的陰性對照溶液各10 μl，分別按上述色譜條件測定，記錄色譜峰。結果黃芩苷的保留時間在17 min左右，樣品峰與其他組分良好分離，陰性對照對黃芩苷的檢測無干擾。結果見圖4。

2.3.4 線性關系考察精密吸取“2.3.2”項下的1～7號黃芩苷對照品溶液10 μl注入色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件分析。以峰面積（Y）為縱坐標，進樣濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得黃芩苷回歸方程為：Y=24.75X-7.358，r=0.9999（n=7）。結果表明，黃芩苷在10.42～104.2 μg/ml范圍內有良好的線性關系。

2.3.5 精密度試驗吸取“2.3.2”項下3號黃芩苷對照品溶液（黃芩苷濃度為41.68 μg/ml）10 μl，注入色譜儀，重復進樣6次，測定其峰面積，結果RSD為0.13%。表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗精密稱取良參胃安片（批號20131118）粉末6份，每份約0.3 g，按“2.3.2”項下方法，分別制備供試品溶液，進樣10 μl，測定峰面積，結果RSD為0.93%，表明方法重復性良好。

2.3.7 穩定性試驗精密取2.3.6項下1號供試品溶液分別于0、2、4、6、10、12 h各進樣一次，按上述色譜條件進行HPLC分析。根據所得待測成分的峰面積計算RSD為1.3%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

圖4 黃芩苷含量測定HPLC色譜圖

2.3.8 加樣回收試驗精密稱取9份良參胃安片（批號20131118，黃芩苷含量為7.02 mg/g）粉末9份，每份約0.15 g，分別加入2.3項下1號對照品貯備液（黃芩苷含量為208.4 μg/ml）4.0、5.0、6.0 ml，每一濃度平行制備3份，按“2.3.2”項下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，并照上述色譜條件測定，根據測得量和加入量，計算各待測成分的加樣回收率，結果見表1。

2.3.9 含量測定分別取不同批次的良參胃安片片適量，研細，每批次取粉末3份，每份0.3 g，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，依法進行含量測定，結果見表2。

表1 黃芩苷加樣回收率試驗結果（n=9）

表2 十批樣品的含量測定結果

3 討論

良參胃安片的原質量標準中沒有顯微鑒別，本研究中增加了吳茱萸、姜半夏的顯微鑒別。

在鑒別試驗中增加了黃芩、延胡索、香附、烏藥、丹參、郁金的薄層鑒別。黃芩原藥材鑒別的展開系統含有甲苯，為了降低毒害影響，修訂參考相關文獻，選用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，斑點分離度良好。延胡索原藥材鑒別的展開系統含有甲苯，為了降低毒害影響，修訂用石油醚（60～90℃），斑點分離度良好。香附原藥材鑒別的提取液由乙醚改用甲醇，降低毒害影響。烏藥原藥材鑒別的展開劑將含有甲苯的展開劑環己烷-乙酸乙酯（15∶1），斑點分離度良好。丹參原藥材鑒別的提取液由乙醚改為乙酸乙酯，降低提取液的毒性。郁金原藥材鑒別的展開系統斑點分離度不好，選用二氯甲烷-甲醇-醋酸（9∶1∶0.1）為展開劑，斑點分離度良好。

黃芩作為良參胃安片的主要藥味之一，在原質量標準中沒有進行含量測定，該研究中增加了黃芩中主要有效成分黃芩苷的含量測定。根據參考文獻，研究中對流動相比例、供試品提取方法、提取時間、提取溶劑的用量等條件進行了調整和對比，最終確定了本實驗中的色譜條件和供試品提取條件。

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［2016－10－17收稿，2016－11－15修回］［本文編輯：劉一洋］

Study on completing quality control method of Liangshenweian tablet

ZHU Yan，CAO En-hui，LI Mingchun.
Department of Pharmacy，No.401 Hospital of PLA Navy，Qingdao，Shandong 266000，China

ObjectiveTo establish the complete quality standard control methods for Liangshenweian tablet.MethodsThe main components of the preparation，Fructus evodiae，Pinelliae rhizome were identified by microscope，and other main components，Radix scutellariae，Rhizoma corydalis，Cyperus rotundus，Lindera aggregate，Salvia miltrorrhiza，Radix curcumae were identified by TLC.The assay of baicalin was determined by HPLC：Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），mobile phase：methanol-0.2%phosphoric acid solution（43∶57），flow rate：1.0 ml/min，detection wavelength：280 nm，column temperature：30℃，injection volume：10 μl.According to the peak areaofbaicalin，thenumberoftheoreticalplatesshouldbehigherthan2500.ResultsInmicroscopic identification，the cell shapes were consistent with that of the main components respectively.The samples displayed the same spots and colour which were as the same Rf values as the reference substance by TLC，with no interference from negative control.Baicalin had good linear correlation in the range of 10.42-104.2 μg/ml. ConclusionThe method is simple and repeatable，and can be used for quality control of Liangshenweian tablet.

Liangshenweian tablet；Quality standard；Baicalin；HPLC；TLC

R927.11

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.05.025

266000山東青島，海軍401醫院（朱燕，曹恩惠，李明春）

李明春，Email：LMC401y@163.com