慢性功能性便秘患者的腸道菌群分析

黃林生 高仁元 嚴雪冰 祝琦 潘成 尹明明 李豪孔程 張鵬 沈通一 秦環龍

慢性功能性便秘患者的腸道菌群分析

黃林生1，2，3高仁元2，3嚴雪冰2，3祝琦2，3潘成2，3尹明明2，3李豪2，3孔程2，3張鵬2，3沈通一2，3秦環龍1，2，3

目的 探討慢性功能性便秘患者與健康對照組之間腸道菌群的差異。方法 選取便秘組和健康對照組共計20人，留取新鮮糞便樣本，冰塊運送至實驗室并存放于-80度冰箱。采用16S rRNA測序技術檢測V4區鑒定菌群。結果 發現兩組人群的菌群豐富度差異有統計學意義（P＜0.05），菌群多樣性差異無統計學意義。便秘患者與健康對照組之間的腸道細菌組成在門和屬水平差異均存在顯著統計學意義（P＜0.05）。在門水平，便秘患者腸道中放線菌門（Actinobacteria）豐度顯著增加（Z=-3.10，P＜0.05），而變形菌門（Proteobacteria）豐度顯著降低（Z=-2.42，P＜0.05），在屬水平發現20個菌屬差異存在統計學意義（P＜0.05）。其中，Coprobacillus（Z=-2.10，P＜0.05）、Hungatella（Z=-2.31，P＜0.05）、Holdemanella（Z=-2.32，P＜0.05）、Anaerostipes（Z=-3.78，P＜0.01）、Bacteroidales_S24-7_group_norank（Z=-2.15，P＜0.05）、Bacteroides（Z=-3.78，P＜0.01）、Blautia（Z=-3.78，P＜0.05）、Collinsella（Z=-3.02，P＜0.05）、Dorea（Z=-2.95，P＜0.05）、［Eubacterium］_ruminantium_group（Z=-2.70，P＜0.05）、Erysipelotrichaceae_UCG-003（Z=-3.10，P＜0.05）、Ruminococcaceae_uncultured（Z=-2.50，P＜0.05）、Parabacteroides（Z=-2.87，P＜0.05）菌屬在便秘患者的腸道中豐度明顯增多，而Megasphaera（Z=-2.31，P＜0.05）、Paraprevotella（Z=-2.94，P＜0.05）、Prevotella_2（Z=-3.10，P＜0.05）、Prevotella_9（Z=-3.68，P＜0.01）、Enterococcus（Z=-2.27，P＜0.05）、Catenibacterium（Z=-2.48，P＜0.05）、Clostridium_sensu_stricto_1（Z=-2.50，P＜0.05）菌屬在健康對照組的腸道中豐度明顯增多。結論 慢性功能性便秘患者的腸道菌群與健康人群的菌群存在較大差異，通過改變腸道菌群可能成為治療慢性功能性便秘的新策略。

便秘； 腸道菌群失調； 菌群豐度； 16S rRNA

隨著生活節奏的加快以及飲食結構的改變，便秘已經成為一種常見的腸道疾病。Mugie等［1］對涉及便秘的58篇流行病學文章進行系統性回顧發現，成人中便秘的平均患病率為16%，而在60歲以上的老年人中患病率高達33.5%，且女性患病率比男性高，約為1.5：1。便秘是一種以排便次數減少、排便困難和費力以及排便不盡感為主要臨床表現的腸道疾病。而慢性功能性便秘是指排除腸道器質性病變和全身系統性的疾病以及藥物作用因素所致的便秘。長期的便秘不僅影響個體的正常生活，還會增加心腦血管疾病、大腸癌的患病風險［2］。針對便秘的治療方法有很多，傳統的瀉劑治療方式存在諸多的局限性，不能從根本上解決便秘的病因。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據表明慢性功能性便秘患者腸道菌群往往存在不同程度的比例失調。本研究旨在對慢性功能性便秘患者和健康人群的腸道菌群進行比較，以期發現一些具有疾病特征性的菌群，從而為便秘相關的菌群研究提供基礎，也為便秘的微生態治療提供理論基礎和實踐依據。

資料與方法

一、臨床資料

選取2016年1月至2016年12月在上海市第十人民醫院微生態門診收治的10名便秘患者和在社區招募的10例健康人群為研究對象。本研究通過了上海市第十人民醫院倫理委員會審核，所有參與研究的患者均簽署了知情同意書。

（一）便秘病人納入標準

1.符合便秘羅馬Ⅲ診斷標準［3］：（1）在就診之前三個月內出現2種或2種以上的情況：a.至少25%的排便感到費力；b.至少25%的排便為干球糞或硬糞；c.至少25%的排便有不盡感；d.至少25%的排便有肛門直腸梗阻感和（或） 堵塞感；e.至少25%的排便需手法輔助（如用手指協助排便、盆底支持）；f.每周排便少于3次。（2）在未使用瀉劑的情況下很少能出現稀便。（3）沒有達到腸易激綜合征（IBS）的標準；2.在確診之前至少有6個月的臨床癥狀；3.近三個月未使用抗生素、益生菌和導致便秘的藥物；4.近3個月經腸鏡檢查或在入組前加做腸鏡檢查排除了腸道器質性的病變；5.經直腸指檢和結腸傳輸試驗符合便秘輔助檢查要求的。

（二）健康組的人群納入標準

1.沒有便秘的疾病；2.近三個月沒有服用抗生素、藥物和益生菌制劑。

二、方法

在門診對便秘組人群和健康對照組人群分別留取新鮮糞便樣本，并放在-80度冰箱保存，在實驗室進行分裝后送檢，采用16S rRNA細菌檢測技術鑒定腸道菌群，并對兩組樣本進行菌群差異分析。

（一）16 RNA細菌檢測方法

（1）首先對樣本進行基因組DNA抽提，完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA；（2）進行PCR擴增，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測；（3）參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor? -ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合；（4）Illumina平臺文庫構建與Illumina平臺測序。

（二）生物學信息學分析

分析前先對原始數據進行過濾處理，得到優化序列。然后在去除嵌合體序列后進行OTU聚類分析，對OTU的代表序列作分類學分析。基于OTU聚類分析結果，再對OTU進行豐度（Ace和Chao指數）和多樣性（Shannon和Simpson指數）分析以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，再對各個分類水平上進行群落結構的統計分析。

三、統計學分析

所有實驗數據均使用SPSS17.0統計軟件和GraphPa rism7.0軟件分析。計量資料（兩組人群的身高、體重、BMI指數、平均每周排便次數、平均便秘時間指標）均采用均數±標準差表示，樣本比較采用t檢驗。兩組樣本的菌群差異性比較（門、屬水平）均采用非參數檢驗（Mann-Whitney U秩和檢驗）。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、人群基本信息

本研究中便秘組納入男性7例，女性3例，年齡38～85歲，平均年齡（71.00±4.89）歲；平均身高（168.70±2.30）cm，平均體重（63.20±3.24）千克，BMI指數（22.13±0.82）kg/m2，平均每周排便次數為（1.80±0.21）次，平均便秘時間（105.60± 35.95）個月。健康對照組中男性8例，女性2例，年齡60～75歲，平均（71.40±0.67）歲，平均身高（166.40±2.01）cm，平均體重（68.30±2.42）千克，BMI指數為（24.64±0.65）kg/m2，平均每周排便（6.70±0.15）次，均無便秘病史。兩組在年齡、身高、體重方面差異無統計學意義（t=0.08，P=0.93；t=0.74，P=0.45；t=1.26，P=0.22），但是兩組在BMI指數、每周排便次數、排便時間上差異存在統計學意義（t=2.40，P=0.03；t=5.6，P＜0.0001；t=2.90，P=0.01）（表1）。

二、兩組腸道菌群豐度和多樣性比較

Chao指數和Ace指數是估計樣品中所含OTU數目的指數，常用于評估菌群的豐富度。對兩組的腸道菌群在進行統一聚類和抽平后進行分析，發現兩組在豐富度（Ace指數和Chao指數）上差異存在統計學意義，健康組的腸道菌群豐度明顯增高，而慢性功能性便秘患者的腸道菌群豐度顯著降低。兩組在多樣性上差異無統計學意義（Shannon指數和Simpson指數）（表2，圖1）。

三、菌群在門、屬水平的差異性比較

在門水平，兩組在變形菌門（Z=-2.42，P＜0.05）和放線菌門（Z=-3.10，P＜0.05）差異存在統計學意義（表3）。在便秘人群中Actinobacteria水平較高，但在健康人群中Proteobacteria水平較高（圖2）。在屬水平，Coprobacillus、Hungatella、Holdemanella、Anaerostipes、Bacteroidales_S24-7_group_ norank、Bacteroides、Blautia、Collinsella、Dorea、［Eubacterium］_ruminantium_group、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Ruminococcaceae_ uncultured、Parabacteroides菌屬在便秘病人的腸道中明顯增多，Megasphaera、Paraprevotella、Prevotella_2、Prevotella_9、Enterococcus、Catenibacterium、Clostridium_sensu_stricto_1菌屬在正常人群的腸道菌群中明顯增高群中明顯增高，20個菌屬差異均存在統計學意義。取菌屬所占比＞0.01為有閾值水平，共計3個菌屬存在差異（圖3）。

表1 人群的基本信息（±s）

表1 人群的基本信息（±s）

組別例數年齡（歲）身高（cm）體重（Kg）BMI指數（Kg/m2）每周排便次數（次）便秘時間（月）便秘組1071.00±4.89168.70±2.3163.20±3.2422.13±0.821.80±0.21105.6 0±35.95健康組1071.40±0.67166.40±2.0668.30±2.4224.64±0.656.70±0.150.00 Z值t=0.08t=0.74t=1.26t=2.40t=5.60t=2.90 P值P=0.93P=0.45P=0.22P=0.03P＜0.01P=0.01

討 論

目前慢性功能性便秘微生態研究正不斷受到研究人員的關注。目前研究發現慢性便秘不僅與機體解剖、腸道動力以及其他生理功能改變有關，而且與腸道微生態的改變密切相關。由于飲食結構、生活方式和遺傳的差異性，使腸道菌群具有較大的個體差異，因此需要找出便秘人群具有特征性的可能致病菌群具有十分重要的意義。

本研究發現便秘患者的排便頻率顯著少于正常組，通過16S rRNA測序發現，便秘組的腸道菌群豐度顯著低于健康組，而多樣性無明顯差異。這與Tim等［4］在兒童中研究的結論一致。在門水平，本研究發現放線菌門相對豐度在便秘組中顯著增高，而變形菌門相對豐度在便秘組中顯著降低。在屬水平，本研究發現20種菌屬在兩組之間存在顯著差異，按照相對豐度大于1%進行篩選，發現Paracteroides和Bacteroides在便秘組中顯著富集，而Prevotella_9在便秘組中顯著降低。既往的研究中發現便秘人群與健康人群有統計學意義的細菌也各有不同，Gopanandan等［5］在研究中發現患有結腸慢傳輸的便秘病人腸粘膜菌群與其他便秘病人和健康對照組有顯著差異，擬桿菌屬在便秘病人的結腸粘膜中顯著增高，Firmicutes（Faecalibacterium，Lactococcus和Roseburia）能夠促進結腸傳輸，糞便中的甲烷代謝產物影響了糞便的菌群構成，但不會影響結腸的傳輸。在本研究中Firmicutes在便秘組與健康組中卻未發現統計學差異。Attaluri在對48例慢性傳輸性便秘（slow transi onstipation，ST）和48例非慢性傳輸型便秘 （norma ransi onstipation，NT） 和非便秘的人群進行比較時發現慢性傳輸型便秘的腸道內產甲烷梭菌（Methanogenus）的量明顯增高，甲烷等代謝產物在ST的患者中是最高的，NT其次，在正常人中最低［6-7］。Zoppi等［8］在研究中發現便秘兒童中clostridia和bif i dobacteria菌屬含量是增高的，在本次研究中未發現相似的改變。Tim等［4］在對76名便秘兒童的菌群與健康組進行對比分析發現，兩組在擬桿菌屬（脆弱擬桿菌、卵形擬桿菌）、長雙岐桿菌、Parabacteroides、Alistipe i negoldii差異存在統計學意義。Parthasarathy等［5］在對25名便秘成人和25名健康人的結腸粘膜的菌群分析中發現Bacteriodetes菌屬在便秘患者中是增高的。而在本次研究中發現Parabacteroides和擬桿菌屬也在便秘人群的腸道中顯著增加，說明本研究結果具有較好的可信度。

圖1 圖示便秘組和健康對照組之間豐度（Ace和Chao指數）和多樣性（Shannon和Simpson指數）差異*P＜0.05

Dan等［9］在對便秘病人服用合生元的試驗中發現合生元能夠顯著改善病人的排便情況，使AGACHAN評分明顯增高。Veronica等［10］在研究中通過對便秘病人使用Lactobacillu euteri菌發現益生菌能夠顯著改善便秘病人的排便狀況。糞菌移植也逐漸成為便秘的另一種治療方法，Tian等［11］在對24例慢性結腸傳輸型便秘的患者進行3天的鼻胃管灌注法糞菌移植后觀察到在12周后，臨床效果得到提高和緩解的比例分別達到50%和37.5%。可見針對便秘患者進行基于腸道菌群的療法也具有一定的有效性。

圖2 便秘組和健康對照組之間放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）的豐度差異*P＜0.05

圖3 便秘組和健康組菌群在屬水平的Heatmap圖

表2 CFC和HC在屬水平顯著差異菌群的相對豐度（%）

表3 CFC和HC在門水平菌群的相對豐度比較（%）

關于腸道菌群和胃腸道蠕動之間的關系，很多無菌老鼠的實驗中揭示了胃腸道缺乏菌群定植與腸道運動障礙有緊密的聯系［12-14］，但是具體的病理機制仍然不明確，一種解釋是細菌能夠調控控制腸道蠕動相關基因的表達［15］，另一種解釋為腸道的蠕動依賴發酵產物形成的PH環境、菌群代謝產物形成的滲透作用、腸腔內的氣體（二氧化碳，氫類，甲烷）增多反射性引起腸道平滑肌的收縮作用［16］。一些動物研究還發現了特定的菌群與腸道動力之間的關系，Bifidobacteriu ifidum、Lactobacillu euterii和Lactobacillu ci-dophilus菌群能夠促進腸道的蠕動，Escherichia卻對腸道蠕動有抑制作用［17-19］。

本研究仍存在一定的局限性，首先只選取了10例便秘病人和10例健康人群進行比較，樣本的數量較少，其次本研究未能將地域、飲食習慣、生活方式的差異性等因素納入研究。在本研究的基礎上，針對便秘人群與健康人群存在的菌群差異，采用微生態治療以改善慢性功能性便秘的癥狀和腸道菌群譜已經成為便秘治療的一個重要方向。

總之，本研究初步發現在便秘人群和健康人群中存在顯著差異的菌群，為便秘的進一步微生態研究提供實踐支持。因此，針對有差異的菌群的研究基礎，重新恢復便秘人群的腸道微生態有望未來成為便秘治療一個重要方向。

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Structure analysis of the gut microbiota in chronic functional constipation patients

Huang Linsheng1,2,3,Gao Renyuan2,3, Yan Xuebing2,3, Zhu Qi2,3, Pan Cheng2,3, Yin Mingming2,3, Li Hao2,3, Kong Cheng2,3, Zhang Peng2,3, Shen Tongyi2,3, Qin Huanlong1,2,3.1Shanghai Tenth People′s Hospital Clinical College of Anhui Medical University;
2Department of General Surgery, Shanghai Tenth People′s Hospital, Tongji University School of Medicine;3Research Institute for Intestinal Diseases of Tongji University School of Medicine, Shanghai 200072, China
Correspondence author: Qin Huanlong, Email: qinhuanlong@126.com

Objective T nvestigat h ifference u icrobiot etwee atient ith chroni unctiona onstipation (CFC) an ealt ontrols (HC). Methods 16S rRNA highthroughout pyrosequencin n V4 regio a mploye xamin h ifferenc u icrobiot rof i le etween 10 CFC patient nd 10 HCs. Th btaine at er nalyze sin ioinformatics. Results Th ichness analysi uggeste hat HC av iche u icrobiot han CFC patients (all P＜0.05), whil ignif i cant differenc a bserve h iversit nalysis.Ther a signif i can tructur ifferenc u icrobiota between CFC patient nd HC ot h hylu n enu evels (all P＜0.05). A h hylu evel,Actinobacteri n CFC patient iche ha ha n HCs, but Proteobacteri pposite (all P＜0.05). A he genu evel, 20 gu icrobiot er oun av change elativ bundanc etween CFC patient nd HCs, i hich Coprobacillus, Hungatella, Holdemanella, Anaerostipes, Bacteroidales_S24-7_group_norank, Bacteroides, Blautia, [Eubacterium]_ruminantium_group, Collinsella, Dorea, Erysipelotrichaceae_UCG-003, Parabacteroide nd Ruminococcaceae_unculture er ncrease n CFC patient hile Megasphaera, Paraprevotella, Prevotella_2, Prevotella_9, Enterococcus, Catenibacteriu nd Clostridium_sensu_stricto_1 were increase n HCs. Conclusion Ther a signif i can tructur ifferenc u icrobiot etween CFC patient nd HCs. Therefore, targetin h u icrobiot ysbiosi a promisin herapeuti trategy for CFC patients.

Constipation; Intestina lor ysregulation; Bacteri bundance; 16S rRNA, richness

2016-12-19）

（本文編輯：趙志勛）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.02.008

國家自然科學基金項目（No.81230057；No.81472262；No.81302066）；上海新興前沿技術聯合攻關項目（No.SHDC12012106）

200072 上海，安徽醫科大學上海十院臨床學院1；200072 上海，同濟大學附屬第十人民醫院普外科2；200072 上海，同濟大學醫學院腸道疾病研究所3

秦環龍，Email：qinhuanlong@126.com