濕熱痹阻型類風濕關節炎患者超氧化物歧化酶的變化及關聯規則挖掘研究

郭錦晨，劉健，忻凌，萬磊，汪元，周巧，黃旦，宋倩

(1.安徽中醫藥大學研究生院，合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

·臨床研究·

濕熱痹阻型類風濕關節炎患者超氧化物歧化酶的變化及關聯規則挖掘研究

郭錦晨1，劉健2，忻凌2，萬磊2，汪元2，周巧1，黃旦1，宋倩1

(1.安徽中醫藥大學研究生院，合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

目的 研究濕熱痹阻型類風濕關節炎(RA)患者血清超氧化物歧化酶(SOD)的變化及相關因素分析。方法 整理安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科2012年6月至2015年10月濕熱痹阻型類風濕關節炎住院患者的病歷資料。采用SPSS 17.0和SPSS Clementine 12.0軟件Aprior模塊分析RA患者血清SOD的變化及相關影響因素。結果 355例濕熱痹阻型RA患者血清SOD值與正常參考值相比較，下降的有182例(占51.27%)。相關性分析示：血清SOD與免疫球蛋白M、低密度脂蛋白膽固醇、抗環瓜氨酸肽抗體呈負相關，與C4呈正相關(P<0.05或P<0.01)。治療后血清SOD上升與車前草紅花、車前草桃仁、車前草薏苡仁、車前草陳皮、車前草茯苓等中藥組合存在明顯關聯關系，置信度均在90%以上。治療后血清SOD上升與外用藥芙蓉膏和消瘀接骨散也存在明顯關聯關系。結論 SOD參與RA的發病過程，其機制可能與免疫炎癥、氧化應激、脂代謝等相關。中醫藥內外合治均可提高機體SOD水平，調節氧化/抗氧化系統動態平衡，緩解臨床癥狀。

關節炎,類風濕；超氧化物歧化酶；健脾；化濕；通絡；危險因素

類風濕關節炎(RA)是一種以慢性滑膜炎癥為主要特征的自身免疫疾病，關節炎癥刺激可導致關節內軟骨和骨的破壞，反復遷延多年，最終導致關節畸變及功能喪失[1]。迄今研究認為免疫炎性反應和氧化應激均存在于RA的病理過程，氧化應激是體內氧化與抗氧化作用失衡，導致大量氧化中間產物活性氧(ROS)自由基和活性氮(RNS)自由基的產生，引起組織損傷。ROS還能引起炎性反應及低密度脂蛋白氧化[2]。RA患者體內自由基增多，可引起超氧化物歧化酶(SOD)系統紊亂，抗氧化能力減弱，導致炎癥組織損傷加重，以及RA滑膜分泌的金屬蛋白酶，可直接破壞軟骨[3]。SOD是抗氧化酶家族重要成員之一，通過Nrf2通路可以上調MnSOD和HO-1蛋白表達，可使氧自由基發生歧化反應而被清除，在RA的發病中發揮重要作用。本文根據濕熱痹阻型RA患者血清SOD水平來研究其變化特征及影響因素，并探討中藥及外用藥對SOD的影響，為優化處方提供依據。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 西醫診斷標準：依據1987年美國風濕病學會類風濕關節炎的診斷標準，參考2009年美國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯盟提出的最新RA分類標準和評分系統[4]。中醫診斷標準：參照《中醫內科學》《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]，痹證辨證屬濕熱痹阻型。

1.2 納入及排除標準 納入標準：(1)符合RA診斷標準，中醫辨證屬濕熱痹阻型者；(2)治療前后均有實驗室生化檢查。排除標準：(1)不符合RA診斷標準；(2)合并有嚴重疾病以及嚴重關節外表現需要使用糖皮質激素的患者；(3)精神病患者；(4)治療前或治療后無實驗室生化檢查單；(5)研究者認為不宜納入者。

1.3 一般資料 收集安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科2012年至2015年濕熱痹阻型RA住院患者的病歷資料，確診濕熱痹阻型RA患者1204例，生化檢驗SOD患者355例。選取下列生化指標：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、補體C3、補體C4、紅細胞沉降率(ESR)、血小板(PLT)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、類風濕因子(RF)、SOD、抗環瓜氨酸肽抗體(CCP-AB)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白-A1(APO-A1)、載脂蛋白-B(APO-B)。所涉及生化指標均在安徽中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心檢測，ESR采用魏氏法，IgA、IgM、IgG、C3、C4、PLT、RF、hs-CRP、CCP-AB、TG、TC、HDL-C、LDL-C、APO-A1、APO-B采用日立7060型全自動生化分析儀進行測定，SOD采用黃嘌呤氧化酶比色法測定，正常參考值129～216 U/mL。

1.4 數據挖掘

1.4.1 數據挖掘的數據預處理 用藥后下血清SOD上升取值定為1，不變或下降定為0；(注：治療指標變化有利于減輕疾病時取值為1，反之，不利于疾病發展取值為0)。治療中藥“有”取值定為1，“無”取值定為0。包括補充缺失數據，剔除錯誤數據。

1.4.2 數據挖掘 關聯規則分析：采用SPSS Clementine 12.0中的Aprior模塊為挖掘工具來探討中藥及外用藥與血清SOD的關系。關聯規則置信度設為70%，支持度設為20%。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計分析，指標間相關性采用Spearman分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 濕熱痹阻型RA患者SOD值 355例濕熱痹阻型RA患者血清SOD值與正常參考值(129～216 U/mL)相比較，下降的有182例(占51.27%)，正常的有172例(占48.45%)，上升的有1例(占0.28%)。

2.2 濕熱痹阻型RA患者血清SOD與實驗室指標相關性分析 相關性分析示血清SOD水平與IgM、LDL-C、CCP-AB呈負相關，與C4呈正相關(P<0.05或P<0.01)。與其他實驗室指標無相關性。見表1。

2.3 中藥與濕熱痹阻型RA患者SOD的關聯分析 設定前項為中藥，且為2位，后項為SOD，最小置信度為70%，最小支持度為20%。經Aprior模塊分析,前項與后項置信度結果排前5位的見表2。

2.4 外用藥與濕熱痹阻型RA患者SOD的關聯分析 設定前項為外用藥(芙蓉膏、消瘀接骨散)，后項為SOD，最小置信度為70%，最小支持度為20%。經Aprior模塊分析，前項與后項支持度、置信度結果見表3。

表1 濕熱痹阻型RA患者血清SOD 與實驗室指標相關性分析

表2 中藥與濕熱痹阻型RA患者SOD的關聯分析

表3 外用藥與濕熱痹阻型RA患者SOD的關聯分析

3 討論

RA是以滑膜炎為特征的全身性免疫性疾病，細胞因子參與了RA的整個病理過程，其中IL-1、TNF-α、IL-4、IL-10起著很重要的作用，IL-1、TNF-α是引起RA關節病變的主要炎性細胞因子[6]。RA患者自身免疫性T細胞還可以對自身抗原產生特異性免疫應答，導致大量炎性細胞因子釋放，引發遲發性超敏反應，形成關節部位炎性損傷[7]。現代研究發現，氧化應激和免疫炎性反應共同參與RA的發病過程，細胞因子失衡貫穿全程，氧化應激失調也伴隨發病始末。RA患者體內自由基增多，可引起SOD系統紊亂，抗氧化能力減弱，導致炎癥組織損傷加重，以及RA滑膜分泌的金屬蛋白酶，可直接破壞軟骨[8]。

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如ROS和RNS自由基產生過多，氧化程度超出氧化物清除能力，氧化系統和抗氧化系統動態失衡，機體內氧化還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎。SOD又稱為肝蛋白、奧古蛋白，是由金屬輔酶與蛋白質構成的一種金屬酶，是機體內氧自由基的頭號殺手，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗福射、抗衰老等作用。可以通過歧化反應將超氧自由基轉變為H2O2和水，之后GSH-Px和CAT可再將H2O2轉化為水，從而保護細胞免受氧化應激損傷。Nrf2信號通路還可調控HO-1作用于血紅素分解的副產物，可以選擇性地抑制脂多糖(LPS)誘導的促炎因子 TNF-α、 IL-1、MIP-1β的增加，同時增加LPS誘導的IL-10的表達，從而在炎癥導致的功能紊亂中發揮保護作用。本研究發現，在355例濕熱痹阻型(活動期)類風濕關節炎患者中，有182例(占51.27%)患者的血清SOD水平低于檢測正常值。相關性分析示血清SOD水平與IgM、LDL-C、CCP-AB呈負相關，與C4呈正相關(P<0.05或P<0.01)。說明疾病活動、免疫炎性反應、脂代謝均不同程度影響了濕熱痹阻型RA患者SOD水平的降低，而SOD水平的下降，濕熱痹阻型RA患者機體的氧化/抗氧化失衡又導致疾病活動、免疫炎性反應、脂代謝紊亂的發生。抗環瓜氨酸肽抗體(抗CPP抗體)對RA具有高特異性、高敏感性，在疾病早期即出現，與疾病活動度、關節結構損傷密切相關，是骨侵蝕破壞的獨立風險預測因子[9]。活動期RA患者自身抗體或炎性因子表達升高，引起體內營養物質代謝的變化，還有自由基過量堆積，可引起不飽和脂肪酸氧化過程損傷關鍵的呼吸鏈酶，改變DNA及其相關蛋白[10]。脂代謝的紊亂與RA疾病的活動性呈一定關系，血液中炎性因子的水平明顯升高，可以作用于外周組織如脂肪、肝臟、血管內皮等，導致脂代謝紊亂、內皮功能障礙等[11]。因此，濕熱痹阻型(活動期)RA患者SOD水平降低可以從側面反映RA的疾病活動、免疫炎癥、脂代謝水平，說明SOD可以作為評價RA病情活動度的重要指標。

RA的中醫學病機為“脾胃虛弱、濕濁內生，氣血不足、營衛失調，痰瘀互結，脈絡阻滯”，中醫證候呈現“脾虛濕盛、虛實夾雜”的臨床特征[12-13]。脾虛濕盛是RA 病機的特征之一，健脾化濕通絡法為基本大法，從脾論治是安徽中醫藥大學第一附屬醫院對風濕病的辨治特色療法。外感濕熱，或素體濕盛，日久化熱，或外感風熱，與濕相合，或素體陰虛，復感風寒濕邪，寒濕從熱化，濕熱留戀于肢體經絡，蘊結壅阻而為濕熱痹阻之證(RA活動期)[14-15]。由關聯結果分析可知，治療后血清SOD上升與車前草紅花、車前草桃仁、車前草薏苡仁、車前草陳皮、車前草茯苓等中藥組合存在明顯關聯關系，置信度均在90%以上。表明安徽中醫藥大學第一附屬醫院對于濕熱痹阻型RA從脾論治，健脾化濕以治本，清熱利濕以治標，兼以行氣活血化瘀、祛風除濕通絡，標本兼治，攻補兼施。車前草、紅花、薏苡仁、茯苓等中醫藥辨證論治可能通過調節免疫炎性反應、氧化應激狀態，提高SOD活性，清除氧化還原產物，提高機體抗氧化能力，改善RA患者臨床癥狀。現代藥理研究發現，車前草總黃酮[16]可以增強氧化損傷小鼠體內SOD、GSH-Px 活性，抑制過氧化脂質對機體的損傷，車前草所含玫紅酸還可以誘導動脈內皮細中產生血紅素氧化酶1(HO-1)，可通過對抗氧化應激而保護機體細胞免受損傷。紅花提取物紅花黃素可以增加SOD、ATP活性，有效清除氧自由基，減少MDA活性，減輕脂質過氧化[17]。薏苡仁多糖可有效提高小鼠體內SOD、GSH-Px活性和紅細胞GSH濃度，降低機體氧化應激水平，清除活性氧自由基的作用，防止脂質過氧化反應[18]。

中醫外治法種類多、直達病所、起效快、毒副作用少，特別是對脾胃功能有間接保護作用，在急性期可以較快作用于病變部位，清熱解毒，消炎止痛，緩解局部癥狀和患者痛苦。安徽中醫藥大學第一附屬醫院辨治濕熱痹阻型RA外用藥以芙蓉膏[19]、消瘀接骨散[20]為主。本方以活血化瘀藥為主，配合溫里通經之藥，使血熱得行，瘀去新生，有活血化瘀、消腫止痛之效。由關聯結果分析，芙蓉膏、消瘀接骨散與治療后血清SOD上升存在明顯關聯關系，置信度達80%以上。說明外用藥芙蓉膏、消瘀接骨散減輕RA患者局部癥狀可能通過調節氧化/抗氧化系統，增強SOD活性，清除過多的自由基，抑制組織脂質過氧化。

綜上所述，本研究結果表明SOD參與RA的發病過程，其機制可能與免疫炎癥、氧化應激、脂代謝等相關，SOD可以作為評價RA病情活動度的重要指標之一，對病情的發展具有重要影響作用。中醫藥內服外用均可能通過調節氧化/抗氧化系統，增強SOD活性，清除過多的自由基，提高機體抗氧化能力。故在臨床上應合理運用中醫藥優勢內外合治，提高機體SOD水平，調節氧化/抗氧化系統動態平衡，緩解臨床癥狀，改善患者生活質量。

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國家科技支撐計劃課題(2012BA126B02)；國家自然基金青年項目(81403388) ；國家中醫藥重點學科中醫痹病學建設項目(國中醫藥發[2009]30號)；國家臨床重點專科中醫風濕病科建設項目(財社[2013]239號)；安徽省重點實驗室建設項目(1306c083035)

郭錦晨，碩士在讀，Email:602923241@qq.com

劉健，主任醫師，教授，博士生導師， Email:liujianahzy@126.com

R593.22

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10.3969/J.issn.1672-6790.2017.02.020

2016-11-10)