雙熒光標記的膠質瘤原位移植瘤模型的建立

李 旺，黃 焱，田新華，李良成，穆軍博，童俊江

(1. 廈門大學醫學院，廈門，福建 361002；2.福建醫科大學，福州，福建 350122；3.廈門大學附屬中山醫院，廈門，福建 361004；4.廈門大學藥學院，廈門，福建 361102 )

研究報告

雙熒光標記的膠質瘤原位移植瘤模型的建立

李 旺1，黃 焱2，田新華3，李良成4，穆軍博1，童俊江2

(1. 廈門大學醫學院，廈門，福建 361002；2.福建醫科大學，福州，福建 350122；3.廈門大學附屬中山醫院，廈門，福建 361004；4.廈門大學藥學院，廈門，福建 361102 )

目的 建立一種穩定、可實時監測的膠質瘤原位移植瘤裸鼠模型。方法 用帶有熒光素酶(luciferase-Luc)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein-GFP)基因的慢病毒感染U251神經膠質瘤細胞，流式細胞儀篩選穩定表達GFP-Luc熒光的細胞系，并通過CCK-8實驗、細胞周期實驗、Transwell腫瘤遷移及侵襲實驗等評價熒光細胞的增殖、遷移和侵襲能力是否改變；將細胞接種至裸鼠大腦尾狀核，建立膠質瘤原位移植瘤模型，利用小鼠活體成像系統監測腦內腫瘤的生長情況，并通過石蠟切片，HE染色評價細胞在裸鼠腦內的病理特征及成瘤能力。結果 成功構建穩定表達GFP熒光和luciferase熒光的U251膠質瘤細胞系及動物模型，慢病毒整合并未改變細胞的增殖、遷移及侵襲能力；模型生長周期適中，成瘤率高，瘤體在顱內生長穩定，HE切片符合人膠質瘤特征。結論 雙熒光標記的膠質瘤細胞相比于傳統細胞更有利于膠質瘤動物模型的實驗研究；U251-GFP-Luc膠質瘤細胞裸鼠模型，其腫瘤生長和病理特性與人膠質瘤相似，且可實時觀察腫瘤生長，可作為膠質瘤實驗研究的理想動物模型。

神經膠質瘤；熒光；活體成像；模型，動物；原位移植

神經膠質瘤是顱內最常見的腫瘤之一，因其高死亡率受到神經外科醫師的關注，雖然手術、放療、化療技術不斷改進，但復發率高，預后仍然很差[1]。究其原因在于未能闡明膠質瘤的發生發展過程，特別在腫瘤生長階段難以實時觀測其顱內生長狀況，因此建立一種無創的、可實時監測的膠質瘤動物模型，是研究腦膠質瘤的發病機制和探索治療方法的必要所在[2]。

目前，顱內腫瘤的監測一般需CT、MRI、PET等影像學設備，操作復雜、價格昂貴，不適合樣本量較大的動物實驗，隨著生物示蹤技術的發展及應用，GFP和luciferase基因標記的雙熒光系統標記的細胞在腫瘤動物模型的研究中顯示出安全性高、操作方便、價格低廉、可實時定量監測等巨大的優勢已成功應用于實驗研究[3-8]。本研究選取常用的人膠質瘤細胞U251，并采用GFP-luciferase基因標記后篩選出穩轉細胞株，建立一種無創的、可實時監測的膠質瘤動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

細胞和小鼠 U251膠質瘤細胞購于上海中科院細胞庫。BALB/c裸小鼠12只，購于廈門大學實驗動物中心【SCXK(滬) 2012-0002】，體重18～20克，鼠齡6～8周，飼養于廈門大學實驗動物中心SPF環境【SYXK(閩)2013-0006】,所做動物實驗均按實驗動物使用的“3R”原則給予人道的關懷。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：DMEM培養基和PBS緩沖液購于Hyclone公司；胚胎牛血清FBS購于Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；熒光素酶底物購自美國Gold Biotechnology公司。

1.2.2 儀器：倒置熒光顯微鏡購于德國Carl Zeiss 公司，小鼠腦立體定向儀購于安徽正華生物儀器有限公司，Hamilton微量注射器、微量注射泵購于保定蘭格公司，IVIS Lumina Ⅱ小動物活體成像系統。

1.3 方法

1.3.1 慢病毒的生產：轉染前1 d將293FT細胞按50%～70%匯合度接種于100 mm培養皿中，轉染前將完全培養基換成無血清培養基。將5質粒(pHCMV-G, pHCMV-gag-pol, pHCMVRev, pcDNA-Tat以及pHIV1SDmCMVeGFP2Aluc)與polyethylenimine (PEI)試劑按1∶5體積比混勻后加入293FT細胞中，4 h后棄上清液，并換完全培養基繼續培養(48～72) h后取病毒上清液，用0.45 μm濾膜過濾，收慢病毒于-80℃保存。

1.3.2 細胞感染及穩轉細胞的篩選： 取對數生長期的膠質瘤細胞接種于100 mm培養皿中，待匯合度達到70%～80%時，用收集的慢病毒感染細胞，感染24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的表達情況，評估慢病毒感染膠質瘤細胞的效率，并用流式細胞儀篩選出能夠穩定表達GFP-Luc的U251單細胞克隆，將其命名為U251-GFP-Luc。

1.3.3 U251-GFP-Luc細胞的體外發光檢測：將熒光細胞倍比稀釋于96孔板中，細胞數目依次為：1×106，5×105，2.5×105，1.25×105，6.25×104，3.12×104個，將未帶熒光標記的細胞以相同的稀釋倍數作為對照。加入熒光素酶底物(150 μg/mL)，10～15 min后將該板置于活體發光成像系統中檢測各孔的發光強度, 以每秒光子量(photons/s)表示，并采用一元線性回歸分析法分析發光強度與細胞數量的相關性。

1.3.4 U251-GFP-Luc細胞與U251-Control細胞生物學特性的比較:

1.3.4.1 CCK-8細胞增殖實驗：將細胞鋪于96孔板中，每孔2000個細胞，每孔含100 μL培養基，并于鋪板后的第0 h、24 h、48 h、72 h每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃孵育2～3 h后測其450 nm處A值并繪制增殖曲線。

1.3.4.2 細胞周期檢測：取對數生長期的細胞，0.25%胰酶消化，離心棄上清液，PBS洗后加入預冷70%甲醇，4℃固定過夜。第二日，將細胞離心棄甲醇后用PBS洗兩次，加入PI工作液(含0.05 mg/mL 碘化丙啶，0.02 mg/mL RNase A)室溫避光孵育30 min后流式細胞儀檢測，Modfit軟件進行周期分析。

1.3.4.3 Transwell細胞侵襲及遷移實驗：Matrigel膠和DMEM按1∶8的比例稀釋后取100 μL鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育過夜。取對數生長期的細胞, 用不含FBS的DMEM培養液將細胞濃度調整為每毫升1×105個，取細胞200 μL接種于Transwell上室，下室加入10% FBS的DMEM培養液600 μL，37℃、5% CO2培養48 h后，固定、染色、干燥后顯微鏡下隨機選取5個不同視野，計算穿膜細胞數。 Transwell細胞遷移實驗除不用鋪膠外，其余步驟相同。

1.3.5 體內膠質瘤模型的建立及生物發光活體成像：稱量裸鼠的體重，建立基礎體重曲線。5%水合氯醛8 μL/g麻醉，將麻醉的裸鼠固定在小鼠腦立體定向儀上，酒精消毒后延矢狀縫剪開頭皮1 cm，在矢狀縫和冠狀縫焦點(前囟)偏右3 mm，靠上1 mm處(定位于尾狀核)鉆骨窗，直徑約0.5 mm，將U251和U251-GFP-Luc細胞分別用PBS制備細胞懸液，每只裸鼠1×106個細胞通過微量注射泵緩慢注射入腦內(從骨窗處進針3.5 mm，退針1 mm，注射20 min，注射完停針5 min后緩慢退出)。用骨蠟封好骨窗，并縫合好頭皮，碘伏消毒。

定期觀察裸鼠的后期反應。分別于移植后的第0、7、14、21、28 天，腹腔注射熒光素酶底物10～15 min(底物濃度15 mg/mL，10 μL/g)，在小動物活體成像儀上進行顯像，并利用活體成像分析軟件分別記錄在接種膠質瘤細胞后的的熒光圖像及熒光強度值。

1.3.6 腫瘤的生長以及小鼠生存率的評估：記錄小鼠的生存狀態。每天觀察小鼠的生長狀態，每周稱量1次小鼠體重。

1.3.7 病理切片：瀕死的裸鼠經10%的水合氯醛5 μL/g麻醉后，暴露胸腔，經4%多聚甲醛心臟灌流至軀體發白，取出腦組織，浸泡在4%多聚甲醛中24 h，梯度脫水后石蠟包埋、切片、HE染色，在鏡下觀察腫瘤情況。

1.3.8 統計學方法：用SPSS 13.0統計軟件進行結果分析。計量資料均以均數±標準差表示，兩組均數比較用t-檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier 曲線法，生存曲線的比較用Log-rank test。P<0.05為差異有統計學意義，反之為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 帶熒光細胞的分選

經慢病毒感染細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察感染效率均在90%以上，經流式細胞儀分選且長期培養后熒光信號并無明顯衰減(圖1)。

2.2 病毒感染后膠質瘤細胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測和評估

由圖2可見，細胞在96孔板中經倍比稀釋后其熒光強度與細胞數呈現了良好的相關性(R2=0.992)(圖2)。

2.3 細胞生物學特性

圖3A的增殖曲線表明：細胞經慢病毒轉染后其增殖能力無明顯改變，差異無統計學意義(P>0.05)；細胞周期檢測：GFP-Luc 組與對照組均以G0/G1期細胞為主，各期細胞數差異無統計學意義(P>0.05)(圖3 B,C)；遷移實驗中，GFP-Luc 組與對照組的細胞數分別為353.8±12.07，355.8±10.43，差異無統計學意義(P>0.05)(見圖3 D,E)；侵襲實驗中，GFP-Luc 組與對照組的細胞數分別為344.4±11.59，348.4±13.5，差異無統計學意義(P>0.05)(圖3 F,G)。

2.4 膠質瘤細胞裸鼠原位模型的評價

2.4.1 Balb/c裸鼠膠質瘤原位移植模型的建立：所有裸鼠都成功接種，術后均恢復良好。

2.4.2 裸鼠的生存狀況：兩組均在第16～20天開始出現覓食、飲水減少；第27～29天開始出現身體消瘦，皮膚彈性下降，反應遲鈍；32～34 d出現明顯顱內高壓癥狀，眼球突起，軀體向一側偏癱，精神極度委靡，軀體枯瘦如柴，呈現瀕死狀態，中位生存期為32 d，分別繪制其生存曲線，經比較兩組生存曲線差異無統計學意義( Log-rank test,P>0.05)(圖4)。

2.5 裸鼠生物發光活體成像

U251-GFP-Luc組在接種第1周后即可檢測到腦部熒光信號，且隨著時間的推移，所有可檢測到的熒光信號逐漸增強，在第4周時信號強度達到飽和(圖5)。

2.6 腦組織形態及病理檢測

如圖6所示：肉眼觀可見腦組織在右側尾狀核部位呈現圓形黃綠色區域，并可見明顯中線左移，HE切片顯示腫瘤區無明顯包膜，與正常腦組織界限清楚，核異形性顯著，大小不均一。

3 討論

近年來，隨著人們對膠質瘤研究的逐步深入，各種治療的新思路、新方法陸續投入到臨床前及臨床實踐應用中，但效果不太理想，大量在動物實驗成功而臨床評價較差的經驗說明動物模型并沒有反應出患者腫瘤真實的生理學特性，因此建立一種可靠的、穩定的膠質瘤原位移植模型是科研工作者急需解決的問題。

成功建立膠質瘤原位移植模型的關鍵在于能夠實時、無創、準確地觀測腫瘤在腦內的發生發展情況，熒光示蹤技術正是解決這一問題的良好途徑。熒光示蹤技術分為生物發光和激發熒光兩種。激發熒光技術是指應用GFP或者RFP等熒光蛋白標記目的細胞，利用紫外光激發使細胞發散出相應波長的光，再通過熒光成像裝置進行顯像[9-11]。激發熒光需要激發光照射，在活體成像上動物的皮毛、肌肉、內臟等都會產生較強的背景光干擾[12, 13]。但GFP操作簡單、易觀測、成像不需要注射底物。生物發光技術是將熒光素酶基因(Luc)整合到細胞DNA中，在觀測前通過腹腔或者靜脈注射熒光素底物，經過熒光素酶的催化反應再進行熒光顯像[14]。生物發光因其是體內的酶促反應，不需要外源性的激發光源，所以排除了背景光的干擾，且光強度與熒光細胞數成呈線性相關，大大提高了影像學上的精確性[15, 16]。Jessamy等[3]證明GFP和Luc的表達具有良好的線性關系(r2=0.9819)，從而可以利用GFP熒光進行GFP-Luc穩轉株的篩選，使體外實驗更易進行。然而目前國內膠質瘤領域應用熒光示蹤技術甚少，相關文獻報道已經構建的并且應用于活體成像的膠質瘤細胞系大多只是C6-GFP在大鼠上的移植瘤模型，由于GFP有較強的背景干擾，其敏感性和精確度都大大降低，且C6是鼠源性膠質瘤細胞，腫瘤并不能完全模擬人膠質瘤的生物學特征[17]。U251細胞系是由Poten及其團隊在從一位75歲惡性膠質瘤男性患者腦腫瘤組織中發現建立的[18]。在過去的幾十年中，U251已經廣泛應用于皮下及原位移植模型中，可以模擬大部分膠質瘤患者的生物學特性[19]。因此本研究選取人膠質瘤U251細胞并用GFP-Luc雙熒光系統對其進行標記，實現了兩種發光系統的優勢互補。

注：A，熒光鏡下GFP的表達(標尺=50 μm)；B，白光下細胞形態(標尺=50 μm)； C，疊加光下細胞形態(標尺=50 μm)圖1 穩轉細胞系U251-GFP-Luc表達GFP情況Note. A. Expression of GFP in the U251 cells observed under a fluorescent microscope. Bar=50 μm. B. Microscopic morphology of cells seen under the white light.(Bar=50 μm. C. The superposition graph of A and B. Bar=50 μm.Fig.1 The expression of GFP in U251-GFP-Luc cells stably expressing fluorescence

圖2 U251-GFP-Luc體外熒光素酶活性與細胞數的相關性Fig.2 Correlation between the number of U251-GFP-Luc cells and luciferase activity in vitro

注：A. 兩組細胞增殖曲線的比較，P>0.05；B,C.兩組細胞周期分布檢測，各期細胞數P>0.05；D,E.兩組細胞遷移能力比較 (標尺=100 μm)，P>0.05；F,G.U251-GFP-Luc 與 U251-control細胞侵襲能力的比較 (標尺=100 μm)，P>0.05。圖3 U251-GFP-Luc 與 U251-Control細胞生物學功能的比較ote. A. Comparison of cell proliferation curves between the two groups，P>0.05. B,C. Detection of cell cycle distribution between the two groups，P>0.05. D,E. Transwell migration assay of the two groups. Bar=100 μm, P>0.05. E,G. Transwell invasion assay of the two groups. Bar=100 μm，P>0.05.Fig.3 Comparison of the biological function between U251-GFP-Luc cells and U251-control cells

圖4 U251-GFP-Luc組與U251-Control組裸鼠生存曲線Fig.4 Survival curves of the nude mice in U251-GFP-Luc group and U251-Control group

圖5 U251-GFP-Luc組與U251-Control組裸鼠原位移植模型活體成像Fig.5 The in vivo images of nude mouse models of orthotopic transplantated glioma in the U251-GFP-Luc and U251-control groups

大量的細胞及動物實驗證明，GFP-Luc雙熒光標記的膠質瘤細胞同時還具備以下優勢：(1)有利于體外實驗研究，GFP熒光可以直接在熒光顯微鏡下觀察，更利于鏡下分析，如在實驗中進行慢病毒感染效率的考察，陽性細胞的比重以及純化情況。(2)可在早期監測腫瘤模型是否制作成功，在接種后當天進行Luc生物發光活體成像檢測，如果在腦室或者椎管中發現腫瘤細胞，多表明細胞誤注入腦室中進入腦脊液循環擴散到其它位置，該模型是不符合實驗要求的。早期剔除實驗不僅可以保證實驗數據的準確性，同時也避免了不必要的時間和資金浪費。

本實驗中，U251-Luc-GFP裸鼠模型成瘤率高，載瘤裸鼠的生存期穩定，活體成像結果顯示隨時間推移，熒光強度逐漸增強，顯示與腫瘤體積有良好的線性關系，證明腫瘤在逐漸長大。以上實驗結果表明U251裸鼠模成瘤時間適中，小鼠生存期穩定，重復性好，是一種理想的膠質瘤原位移植瘤模型，并且為將來膠質瘤進一步研究提供了良好的可視化工具,同時也可以為研究膠質瘤的起源、信號轉導途徑、血管生成以及評估基因治療療效方面提供了強大的可視化監測工具擁有廣泛的應用前景[20-23]。

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Establishment of a nude mouse model of glioma orthotopic xenograft with double-fluorescent labeling

LI Wang1, HUANG Yan2, TIAN Xin-hua3, LI Liang-cheng4,MU Jun-bo1, TONG Jun-jiang2

(1. Medical College of Xiamen University, Xiamen 361002, China; 2. Fujian Medical University, Fuzhou 350122;3. Zhongshan Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004;4. School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen 361002)

Objective To establish a stable and real-time monitorable nude mouse model of orthotopic glioma xenograft. Methods U251 glioma cell line was infected by a lentiviral vector containing green fluorescent protein (GFP) and luciferase (Luc) gene. Cells stably expressing fluorescence of GFP and Luc were sorted by flow cytometry. CCK-8 test and Transwell tumor invasion and migration assay were used to compare the biological features between the cells stably expressing GFP-Luc fluorescence and cells without fluorescence. Then the cells were implanted intracranially in the right caudate nucleus of athymic Balb/c nude mice to establish the tumor model. The growth of intracerebral tumor was monitored over time by a bioluminescence imaging (BLI) system. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to evaluate the histopathological features and tumorigenicity of the transplanted glioma cells in the brain of nude mice. Results U251 glioma cell line with stably expressing GFP-Luc fluorescence and the corresponding orthotopic xenograft model were successfully established. There was no statistically significant difference in the proliferation, invasion and migration abilities between the cells with stably expressing GFP-Luc fluorescence and the control cells. This model showed a high tumor formation rate and stable tumor growth, and takes a moderate time to establish this model. Conclusions Compared with the traditional glioma cells, GFP-Luc-transfected human glioma cells are more feasible for the studies of glioma in vivo. The tumor growth and pathological characteristics in this U251-GFP-Luc glioma model are similar to human glioma, and the growth of this tumor can be real-time monitored. It can be used as an ideal animal model for experimental studies of glioma.

Glioma; Fluorescence; In vivo imaging; Nude mouse models; Orthotopic xenograft

國家自然科學基金(編號：30970733)。

李旺(1990-)，男，研究方向：膠質瘤。E-mail: whatliwang@qq.com。

田新華(1965-)，男，研究方向:神經外科腫瘤。E-mail: txhmd@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0001-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.001

2016-12-14