基于THP-1細胞的皮膚致敏體外檢測方法

陳 彧，喻 歡，秦 瑤，程樹軍，談偉君

(1. 廣東出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東 廣州 510623；2. 廣東藥科大學,廣東 廣州；3. 廣州市華代生物科技有限公司,廣東 廣州 510623)

技術方法

基于THP-1細胞的皮膚致敏體外檢測方法

陳 彧1,2，喻 歡1,3，秦 瑤3，程樹軍1，談偉君2

(1. 廣東出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東 廣州 510623；2. 廣東藥科大學,廣東 廣州；3. 廣州市華代生物科技有限公司,廣東 廣州 510623)

目的 建立基于人細胞系的替代皮膚致敏動物實驗的體外檢測方法(h-CLAT)，并對化學品、日用化學產品和化妝品植物原料進行皮膚致敏性檢測。方法 體外培養(yǎng)人急性單核細胞白血病細胞(THP-1)，不同濃度受試物與細胞共孵育24 h，通過流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD86和CD54活化的差異，并對11種已知皮膚致敏化學物質和9種未知樣品進行皮膚致敏性預測。同時對未知樣品進行豚鼠局部封閉涂皮法驗證。結果 使用h-CLAT方法準確區(qū)分了11種參考物質的皮膚致敏性，9種受試樣品中，7種樣品被判斷為陰性皮膚致敏物質，2種植物提取物被確認為皮膚致敏疑似物質。9種樣品的預測結果與動物實驗一致。結論 h-CLAT體外檢測方法可以代替部分動物測試，用于可溶性皮膚致敏物質的預測。

皮膚致敏；THP-1細胞；h-CLAT；替代方法;接觸性過敏性皮類；致敏化學物；化妝品終產品

接觸性過敏性皮炎是一種由外源物質引發(fā)的皮膚IV型過敏反應，皮膚致敏試驗是化學品分類標識的要求，也是化妝品、日用化學品、醫(yī)療器械等皮膚接觸產品毒性評價的重要內容。傳統(tǒng)動物實驗使用豚鼠最大化法或Buehler法測試，優(yōu)化后的小鼠局部淋巴結實驗(LLNA)以淋巴結T細胞增生定量測定代替皮膚臨床癥狀觀察，提高了動物福利標準[1，2]。在化妝品非動物測試法規(guī)的影響和有害結局通路(AOP)測試概念的指導下，許多體外皮膚致敏篩查實驗逐步得到開發(fā)和被法規(guī)認可。近1年來，列入世界經濟合作和發(fā)展組織( OECD)測試指南TG442的皮膚致敏替代方法包括直接多肽結合試驗(DPRA)、KeratinosenTM法和人細胞活化實驗(h-CLAT)[3-5]。本研究通過建立h-CLAT方法，并將其應用于市售商品的皮膚致敏性檢測和評價，為下一步建立替代方法的組合策略提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源和培養(yǎng)方法：人急性單核細胞白血病細胞(THP-1)由安利(上海)研發(fā)中心饋贈(ATCC號：TIB-202)。采用含25 mmol/L HEPES、0.05 mmol/L β-巰基乙醇、10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于5% CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 細胞培養(yǎng)和檢測試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、β-巰基乙醇(Gibco)、鏈霉素、青霉素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、二甲基亞砜(DMSO)和牛血清白蛋白(BSA)均購自Sigma公司；校準珠、球蛋白阻斷劑、7-氨基放線菌素-D(7AAD)、FITC標記的小鼠單克隆CD86抗體、PE標記的小鼠單克隆CD54抗體、FITC標記的小鼠IgG1、PE標記的小鼠IgG1均購自BD公司。

1.1.3 實驗動物及飼養(yǎng):健康豚鼠190只，雌雄各半，清潔級，實驗動物開始時體重(381±24)g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產許可證：SCXK(粵)2013-0002。動物實驗在廣東檢驗檢疫技術中心進行，使用許可證為 SYXK(粵)2013-0086。

1.1.4 參考物質和測試樣品:十二烷基磺酸鈉(SLS)(CAS:151-21-3)、乳酸(CAS：50-21-5)、肉桂醇(CAS:104-54-1)、丁香酚(CAS:97-53-0)、檸檬醛(CAS:5392-40-5)、肉桂醛(CAS:104-55-2)、苯乙醛(CAS:122-78-1)、沒食子酸丙酯(CAS:121-79-9)、馬來酸酐(CAS:108-31-6)、苯醌(CAS:106-51-4)、二硝基氯苯(CAS:97-00-7)均購自Sigma公司；待測樣品：松茸提取物、微乳卸妝液、當歸提取物、黃芩提取物、人參果提取物、積雪草提取物、金縷梅提取物、馬齒筧提取物和綠茶提取物由廣州市華代生物科技有限公司體外實驗室饋贈，根據受試物的特性選擇生理鹽水或DMSO作為受試物溶劑。

1.1.5 主要儀器:全波長酶標儀(Thermo Scientific 公司)、流式細胞儀(FACS Canto II，美國BD公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)、高速離心機(Sigma公司)和自動細胞計數儀(廣州商特儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和表面標志穩(wěn)定性檢測:復蘇THP-1細胞轉入25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，當細胞密度接近1×106個/mL時進行傳代，每2～3 d常規(guī)換液傳代1次，建議復蘇后的THP-1細胞使用期限為2個月或不超過30代，同時每次實驗以4～4.5 μg/mL DNCB和2 500～3 000 μg/mL乳酸進行表面標志穩(wěn)定性檢測。

1.2.2 化合物細胞毒性測定:吸取500 μL濃度為2×106個/mL的細胞懸液至24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔添加500 μL受試物，每組受試物3個平行。每種受試物按照2倍稀釋系數測試8個濃度，加有不同濃度受試物的培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。暴露結束后從24孔細胞培養(yǎng)板收集細胞分別移入1 mL EP管中，離心(250 r/min，5 min，4℃)收集細胞，用FACS緩沖液(PBS + 0.1%的BSA)清洗后再次離心收集細胞。每支EP管中添加100 μL染料(20 μL 7AAD + 80 μL FACS緩沖液)，常溫、暗室下當染色10 min。用FACS緩沖液清洗2次和使用500 μL FACS緩沖液重懸細胞后移入5 mL流式管中。一次流式進樣約需10 000個細胞，計算IC50(使50%細胞活性抑制的受試物濃度)和CV75(使75%細胞存活受試物濃度)。

1.2.3 化合物暴露和細胞表面標志物測定:THP-1細胞如上述進行24孔鋪板，CV75的濃度作為最高試驗濃度，然后以1.2～1.8為系數稀釋5個濃度。每次實驗需要設置3組對照，分別為培養(yǎng)基對照、DMSO對照和DNCB陽性對照。添加相應濃度的受試物與細胞置于培養(yǎng)箱中共同孵育24 h。隨后按照上述步驟離心收集細胞，將離心獲得的細胞進行蛋白阻斷。將上述細胞平均分配至4支1 mL的EP管中，每管中大約含有3×105個細胞。CD86(FITC-CD86抗體)和CD54(PE-CD54抗體)，對應的同型對照FITC-IgG1和PE-IgG1，以及活率測試所用的7AAD分別根據推薦測試濃度進行配制，可根據實驗具體情況對抗體進行梯度稀釋，每支EP管添加50 μL含有抗體的FACS緩沖液，2-8℃環(huán)境和暗室條件下染色30 min，隨后使用FACS緩沖液清洗2次，再用500 μL FACS緩沖液重懸細胞并移入5 mL流式管，使用流式細胞儀檢測蛋白標志物。

1.2.4 豚鼠局部封閉涂皮法試驗:具體實驗操作參照2015版《化妝品安全技術規(guī)范》的皮膚變態(tài)反應試驗。

1.2.5 結果分析:流式細胞檢測得到相對熒光強度(relative fluorescence index, RFI)，并計算有效作用濃度(effective concentration, EC)，FITC-CD86使用EC150(當CD86的RFI達到150時受試物的最低有效濃度)；PE-CD54使用EC200(當CD54的RFI達到200時受試物的最低有效濃度)。

計算EC150和EC200需分兩種情況：

首先，當陽性值出現時，從最低濃度開始計算，滿足陽性標準的第一個濃度設置為A濃度，隨后根據下述原則選擇下一個濃度為B濃度：第二個濃度的RFI值比第一個濃度的RFI值至少高10%，否則用第三個濃度的RFI值，直到符合大于10%的標準。

(2) 如果測試所得A濃度和B濃度的RFI值均大于150或200，那么公式為：

1.2.6 預測模型：每組化學物質至少重復兩次實驗。在細胞活率大于50%前提下，如果RFICD86≥150和/或RFICD54≥200，則該物質可判斷為皮膚致敏陽性物；否則判斷為陰性物質。另外，細胞在受試物各濃度作用下皆無細胞毒性情況下，都不滿足上述的陽性結果判斷，則可判斷為皮膚致敏陰性物質。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng)

2.1.1 THP-1細胞培養(yǎng)情況：THP-1細胞培養(yǎng)如圖1，細胞密度適中，部分呈現集中生長，形態(tài)一致，無過多碎片或折光差異較大的細胞集團，無特殊突起和觸角，無貼壁舒展情況出現。經測試所用細胞平均倍增時間為37.89±3.93 h，在正常生長THP-1細胞倍增時間43 h±12 h的范圍內。在細胞特性方面保證了實驗的穩(wěn)定可比性。

(左圖：第5代細胞，40×；右圖：細胞倍增曲線)圖1 THP-1細胞培養(yǎng)及質控(Left: The fifth generation of cells, 40×; Right: Cell multiplication curves)Fig.1 THP-1 cell culture and quality control

受試物SamplesIC50(μg/mL)CV75(μg/mL)非致敏物(Non-sensitizer)十二烷基磺酸鈉(SLS)80.13±3.4862.32±5.37乳酸(Lactate)3778.35±180.842901±150.17弱致敏物(Weaksensitizer)肉桂醇(Cinnamicalcohol)495.8±12.51358.8±14.61丁香酚(Eugenol)406.2±13.94305.9±14.18中等致敏物(Mildsensitizer)檸檬醛(Citral)44.24±2.8126.2±2.47肉桂醛(Cinnamaldehyde)26.5±4.8320.4±3.84苯乙醛(Phenylacetaldehyde)41.7±4.5120.2±5.18強致敏物(Strongsensitizer)沒食子酸丙酯(Propylgallate)366.8±21.84124.25±10.51馬來酸酐(Maleicanhydride)947.47±38.14651.24±30.81極強致敏物(Extremesensitizer)苯醌(Benzoquinone)8.3±1.59 5.7±1.56二硝基氯苯(DNCB)9.32±0.315.75±0.15樣品(Unknownsamples)微乳卸妝液(mg/mL)(Microemulsionmakeupremover)3.31±0.45 1.3±1.07松茸提取物(mg/mL)(Tricholomamat-sutakeextract)554.2±20.07235.71±14.42當歸提取物(vol.%)(Angelicaextract)38.16±7.4730.21±6.41黃芩提取物(vol.%)(ScutellariabaicalensisGeorgiextract)8.43±1.257.05±1.13人參果提取物(vol.%)(Ginsengfruitex-tract)24.31±4.5719.84±5.71積雪草提取物(vol.%)(Centellaasiaticaextract)87.18±15.7364.78±9.44金縷梅提取物(vol.%)(Witchhazelex-tract)250.77±36.81190.44±47.18馬齒筧提取物(vol.%)(Purslaneherbex-tract)97.44±24.7880.87±22.41綠茶提取物(vol.%)(Greenteaextract)127.21±19.44110.34±19.87

2.2 受試物細胞毒性檢測

11種化學品和樣品的細胞毒性結果見表1。

2.3 CD54和CD86表達檢測

2.3.1 標準物質的特征性指標結果：根據細胞毒性結果分別對11種標準物質暴露THP-1細胞后的表面標志物CD54和CD86的變化進行檢測，結果如圖2。細胞活率大于50%時，隨著受試物濃度增加，細胞活率整體呈現遞減趨勢，不同化合物的CD54和CD86兩條RFI曲線呈現不同規(guī)律。兩個致敏陰性物質SLS和乳酸的RFI遠遠低于兩條參考值標線。兩種被LLNA劃分為弱致敏性的丁香酚和肉桂醇，CD86和CD54兩個值在某個濃度情況下都超過了臨界值，沒食子酸丙酯和馬來酸酐這兩種強致敏物并非兩個指標都超過規(guī)定閾值。

2.3.2 陽性參考物質的最低有效作用濃度：表2顯示9種皮膚致敏陽性參照物質引起THP-1細胞CD86和CD54表達時的最低有效作用濃度，表明化合物在該濃度下，可引起THP-1細胞表面標志物表達的顯著性增加，并超出預測模型設定的EC150(CD86)和EC200(CD54)閾值。

2.3.3 未知樣品檢測：幾種水溶性樣品的細胞活性測試結果見表1，根據細胞毒性結果分別檢測其暴露細胞后特征標志物的表達情況。結果如圖3，微乳卸妝液、松茸提、人參果、積雪草、金縷梅、馬齒筧和綠茶等7種提取物對應的CD86和CD54的RFI值沒有超過限定閾值。當歸提取物引起THP-1細胞的CD86(EC150=23.54±7.84%)和CD54(EC200=15.37±4.61%)兩個指標的RFI都超過了限定閾值，黃芩提取物只引起THP-1細胞CD54(EC200=2.66±0.74%)的RFI高于閾值。根據判斷標準，當歸和黃芩提取物可能具有皮膚致敏性。在豚鼠局部封閉涂皮法試驗(BT測試)中，采用0.2%(W/V)2,4-二硝基氯苯作為陽性參照物，生理鹽水作為陰性參照物；受試物為9種植物提取物。在致敏后1 h和24 h,各組動物皮膚均未見明顯紅斑和水腫等過敏反應;激發(fā)給藥后24 h,各組均未出現明顯的皮膚過敏反應；激發(fā)給藥后48 h,陽性對照組2只動物(2/10例)出現輕微紅斑,1只動物(1/10例)出現中度紅斑、輕度水腫,3只動物(3/10例)出現輕度紅斑、輕度水腫；當歸提取物組1只動物(1/20)出現輕微紅斑,1只動物(1/20)出現中度水腫；黃芩提取物組2只動物(1/20)出現輕微紅斑和輕度水腫；其它受試的植物提取物相應組別為陰性。

表2 陽性物質引起細胞標志物表達的有效濃度

圖2 11種標準物質的檢測結果Fig.2 Results of sensitization tested from 11 standard materials

圖3 4種樣品細胞標志表達測定結果Fig.3 Results of sensitization from 4 samples

3 討論

外源化合物引起的皮膚致敏是多細胞共同參與的復雜過程，其中朗格漢斯細胞起著承上啟下的作用。從皮膚原代分離朗格漢斯細胞或從外周血分離樹突狀細胞都非常困難，且供體穩(wěn)定性和重復性較差。THP-1細胞是一種來源于急性單核細胞性白血病患者的細胞系，具有類似于皮膚樹突狀細胞的標志。研究表明是體外細胞水平篩查致敏物質的理想模型[6-7]。

由于THP-1細胞容易在培養(yǎng)過程中轉化成其他樹突狀細胞，其穩(wěn)定性對于致敏物篩查非常關鍵，本研究采用DNCB和乳酸常規(guī)檢測細胞表面標志物CD86和CD54，對細胞定期進行質控，減少因為細胞問題影響結果的穩(wěn)定[8]。

本研究選擇OECD指南442E方法研究中推薦的11種皮膚致敏標準物質，建立了基于THP-1細胞的皮膚致敏篩查方法[9]，并將2種非致敏物質和9種致敏物質正確地區(qū)分開來。h-CLAT方法以CD86和CD54的表達變化為判定指標，研究表明，多數致敏物質可同時引起兩種分子表達的變化，有一些化合物只引起其中一種標志物變化。本研究同樣證實，2種強致敏物馬來酸酐和沒食子酸丙酯，只引起了CD54表達的增加，而CD86的表達未達到陽性閾值。CD86為共刺激分子，CD54為細胞粘附分子，在誘發(fā)機制上存在差異，不同類型的致敏化合物可能誘導不同機制的細胞分子表達差異。如果只以CD54的分子表達差異為判定依據(如利用U937細胞建立的U-SENS方法)，則部分致敏物質的特征可能會預測不到。

h-CLAT方法雖然能計算出受試物的最低有效作用濃度EC150(CD86)和EC200(CD54)，但尚不能以此作為評判受試物質皮膚致敏潛力的依據，還需要其它數據支持，如正辛醇-水分配系數、巰基反應性、組織代謝過程模擬等。尤其是當測試物為混合物時，還應包括各個組份的成份、比例和溶劑等信息[10]。

本研究對未知致敏特性樣品的細胞活化檢測結果與動物實驗結果一致，均顯示當歸提取物和黃芩提取物被認為存在可疑致敏成分。當歸提取物主要活性成分為阿魏酸、藁本內脂、正丁烯酰內脂和煙酸等[11]。黃芩提取物的主要成份為黃芩苷，屬于黃酮類化合物，本身具有抗炎和抗過敏的作用，據報道黃芩苷可能存在人群皮膚致敏性[12]。h-CLAT經過驗證對于已知的單一化學物質的皮膚致敏預測性達到80%以上，當聯合多種其他皮膚致敏檢測方法后，相應的預測能力更加穩(wěn)健[13]。同樣地，針對復雜的化合物和植物提取物，相應的體外皮膚致敏檢測方法需要進一步探索。本研究中9種植物提取物經過h-CLAT的檢測，發(fā)現了兩種受試物的致敏性，在植物提取物成分復雜和各個組分含量不明確的基礎上，仍然通過該方法檢測出皮膚致敏性，很大程度上可以認為該物質存在皮膚致敏能力，而相反的，出現陰性結果的物質仍然需要進一步驗證皮膚致敏性[14]。

本方法建立的原理是基于AOP皮膚致敏的關鍵細胞事件，還有針對該通路其它組件的替代方法，如針對分子啟始事件的直接多肽反應試驗(DPRA)、針對角質細胞關鍵事件的ARE - Nrf2熒光素酶檢測方法(KeratinoSens)同樣已被OECD認可為指南方法，其他與AOP相關的替代方法還有U-SENS、Lusens 等處于驗證過程中。這些方法的開發(fā)在一定程度上替代了動物實驗，但實現最終替代動物實驗的目標，還應采用整合測試評估策略(IATA)，合并減少體外方法的數量、確定不同方法的權重，以及建立判定決策樹。

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An in vitro skin sensitization test based on THP-1 cell line

CHEN Yu1,2，YU Huan1,3，QIN Yao3，CHENG Shu-jun1，TAN Wei-jun

Objective To establish an in vitro skin sensitization test, human cell line activation test ( h-CLAT), based on THP-1 cell line (a human acute monocytic leukemia cell line), and to assess the sensitizing potency of plant raw materials of chemical and cosmetic products by this in vitro skin sensitization test. Method THP-1 cells were cultured in vitro and exposed to 11 reference skin sensitization chemicals and 9 samples, by monitoring the cell viability, cell surface marker CD54 /CD86 and relative fluorescence intensity of cells surface after the cells was exposures to the substances, and to discover whether there is a positive reaction. At the same time, Buehler test was used to validate the results of samples tested by h-CLAT. Results 11 reference chemicals were distinguished correctly by h-CLAT. Among the 9 samples tested, 7 samples were recognized as negative sensitizer and 2 plant extracted substances were identified as suspicious skin sensitizer. The qualitative classification of the 9 samples by h-CLAT test was consistent with the results obtained by animal test. Conclusions The h-CLAT-in vitro test can be used to replace some animal tests for the prediction of soluble skin sensitizing substances.

Skin sensitization; THP-1 cell Line; Human cell line activation test, h-CLAT; Alternative methods; Contact dermatitis; Sensitizing chemicals; Cosmetic products

廣東省科技計劃項目(2015A030402005)。

陳彧(1989-)：男，碩士研究生，研究方向：皮膚致敏替代方法研究與驗證, 郵箱: cy94776@163.com。

程樹軍(1971-)：男，研究員，從事替代方法研發(fā)和標準化，郵箱：chengsj@126.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0094-09

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.016

2016-07-31