蕨麻豬與巴馬小型豬臟器指數及低氧相關基因的比較

牛廷獻，王紅義，郭曉宇，陸 璐，申 健，肖 攀，馮小明

(蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科， 蘭州 730050)

研究報告

蕨麻豬與巴馬小型豬臟器指數及低氧相關基因的比較

牛廷獻，王紅義，郭曉宇，陸 璐，申 健，肖 攀，馮小明

(蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科， 蘭州 730050)

目的 研究蕨麻豬與巴馬小型豬臟器指數及低氧相關基因表達量的差異。方法 采用TaqMan探針實時定量PCR(real-time quantitative PCR)技術，檢測蕨麻豬與巴馬小型豬心、肝、脾、肺、腎低氧反應基因表達量的變化。結果 蕨麻豬的腎臟、脾臟指數低于巴馬小型豬，蕨麻豬的心臟、肺臟指數高于巴馬小型豬。蕨麻豬血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 與低氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor 1, HIF-1α)在肺、腎中的表達量明顯比普通豬高(P<0.05或P<0.01)；促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)只在肺中比巴馬小型豬高(P<0.05)。結論 不同物種臟器指數可能是物種對物質環境、能量環境、外界病原體、能量代謝需求等綜合因素進化適應的結果。蕨麻豬低氧相關基因明顯比巴馬小型豬高，揭示在基因方面蕨麻豬具有較強的高原適應性。

蕨麻豬；巴馬小型豬；臟器指數；低氧相關基因；比較

小型豬在解剖學，生理學，疾病發生機理等方面與人相似，在生命科學、人類疾病動物模型及異種器官移植供體等研究領域中具有重要的實驗應用價值[1]。蕨麻豬又稱合作豬，生活在青藏高原甘南藏族自治州合作地區，常年處于惡劣高寒氣候和低劣的飼養條件下生長，使其具有極強的高原環境適應能力。并且長期以來在封閉環境中自繁自養免受外來血緣的雜交影響，從而它形成了一個穩定的原始的地方小型豬種。它生長緩慢、體形矮小、繁殖能力強，是典型的高原小型豬種之一[2,3]。高原低氧、高寒環境使得在此生態條件下的生物具有巨大的生存并進化選擇的能力。長期生存在高原環境中，其生物自身組織器官也在高原環境中慢慢進化，逐步適應高原環境特點，許多高等哺乳動物都產生了相應的高原適應機制。同時動物遺傳進化的分子生物學機制也受到高原環境的影響，長期在此生態體系中，具有適應高原環境的分子遺傳特性[4,5]，其中低氧誘導因子通路是一個典型的高原適應性密切相關的信號通路，它主要維持低氧環境下哺乳動物機體內氧的穩定，從而提升機體的低氧適應能力。本研究對長期生活在高海拔地區的蕨麻豬和生活在低海拔地區的巴馬小型豬臟器指數及各器官低氧相關基因的表達差異進行比較分析，研究蕨麻豬在適應高原環境的生理功能特點及低氧適應的分子生物學特征。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

蕨麻豬與巴馬小型豬均為雄性各6只，體重(15±3)kg。蕨麻豬為甘南合作地區散戶飼養，巴馬小香豬購自第四軍醫大學動物實驗中心(生產許可證號：SCXK(軍)2012-006)。

1.2 試劑

Trizol(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；TaqMan探針(上海生工生物工程有限公司合成)；凝膠回收試劑盒(MN公司)。

1.3 標本采集

動物麻醉處死，取心、肝、脾、肺、腎，用紗布將血漬擦拭干后進行器官稱重，切去少量裝與凍存管，存于-80℃備用。

1.4 探針及引物

18S：p5 AGTCGCCGTGCCTACCAT，p3 CGGGTC GGGAGTGGGTAAT，大小 129 bp，探針CGCCTGCTG CCTTCCTTGGATGTG；VEGF：p5 TTCTTGCCTCGCTC TATCTTC，p3 CGACGAAGGTCTGGAGTGT，大?。?57 bp，探針 CCACTGAGGAGTTCAA CATCGCCAT； EPO：p5 CCGTGACATCCTTAGGTTTGA，p3 AGGT GACTTGGTGCTCCC，大小 210 bp，探針TGTCCACC ACTTCGCTCACCACCA；HIF-1α：p5 CGACAGATAA CACATTAGGACTTC，p3 TGCTACAACATCACCATAC AGT，大小：122 bp，探針 TGGAAGTCGGACAGCCT CACC。

1.5 RNA提取及逆轉錄cDNA

RNA的抽提及逆轉錄說明書實施。

1.6 RT-PCR

反應體系：Taq酶0.3 μL (5U)，dNTPs 1 μL，上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，探針1 μL (20 pM)，用水補足到30 μL；。程序為95℃ 5 min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30 s，40個循環。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 蕨麻豬與巴馬小型豬臟器指數比較

兩種小型豬新鮮器官臟器指數及比較結果見表1。兩種小型豬肝臟指數的差異無統計學意義(P>0.05)，其它肺、脾、心、腎器官臟器指數均有明顯的差異(P<0.05)。其中蕨麻豬肺、心臟器指數明顯大于巴馬小型豬，其差異具有統計學意義(P<0.05)；而蕨麻豬脾、腎器官指數顯著小于巴馬小型豬，其差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 低氧反應基因RT-PCR條件優化

組織提取RNA之后，反轉錄成cDNA，然后對VEGF、EPO和HIF-1α進行RT-PCR檢測，以18S作為內參。首先對PCR退火溫度進行優化，PCR條件的優化結果如圖1，可見不同的退火溫度18S、EPO 60℃退火溫度表達量較高，因此選擇60℃為PCR的退火溫度。HIF-1α和VEGF的表達量在55℃時表達量較高，因此選擇55℃為其PCR的退火溫度。其次以4個梯度濃度的質粒為模板進行RT-PCR擴增，各基因的擴增曲線線性關系良好，18S r=-0.99982，VEGF r=-0.99796，EPO r=-0.99848，HIF-1α r=-0.99562。

2.3 低氧相關基因的表達量變化

比較蕨麻豬與巴馬小型豬低氧相關基因血管內皮細胞生長因子Endothelial growth Factor, VEGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)、低氧誘導因子1α (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1α)在不同器官表達量的差異。結果表明：3個低氧表達基因在蕨麻豬肺組織中表達明顯高于巴馬小型豬(P<0.05)，HIF-1α在腎組織中的表達量蕨麻豬明顯比巴馬小型豬高(P<0.05)；而VEGF在腎中的表達量蕨麻豬顯著高于巴馬小型豬高(P<0.01)(圖2)。

a,b,c,d分別代表18S, HIF-1α, EPO, VEGF；M為marker, N為陰性對照；其中50、55、60分別代表退火溫度50℃、55℃、60℃。圖1 PCR條件優化a,b,c,d represent as 18S, HIF-1α, EPO, VEGF；M as marker; N as negative control; 50, 55, 60 represent as 50℃, 55℃, 60℃.Fig.1 The optimized PCR condition

圖2 低氧表達基因在各臟器中的表達量Fig.2 Expression of hypoxia-related genes in the organs

3 討論

高原土生動物高寒環境低氧適應機制主要研究高原動物的生理功能特點及其低氧調控的分子機制，是近年高原醫學研究的熱點。內臟器官關系到動物的繁殖、生長發育、季節及棲息環境變化，是動物生理功能的物質基礎，其器官質量及指數反映動物的生理功能，可以間接反映出動物對特定環境適合度，通常被作為一種與動物代謝功能相關的指標[7,8]。

心臟不僅是全身組織的供氧中樞，也是清除低氧代謝產物乳酸的主要器官之一。心臟質量的增加可提高動物的御寒的能力[9]。本研究中發現蕨麻豬的心臟指數均明顯大于巴馬小型豬，這是因為蕨麻豬常年生活在高原低氧高寒環境中，心臟指數的增大可以提高其抗寒冷的能力，并具有強大的供養及氧代謝能力應對低氧環境。肺臟是動物體內外氣體交換場所，同時肺臟在動物呼吸過程中起到維持體溫恒定，并具有承載氧氣的能力。高海拔地區動物適應低氧環境的一個途徑就是增加肺臟容積和擴散能力[10]。蕨麻豬棲居于高海拔地區受到低溫和低氧雙重脅迫，低氧刺激被動增加肺承載氧的能力，這可能使得氧耗與代謝產熱的速率降低[11]。而動物自身對環境的生存選擇性使得對這種制約產生應對機制，肺臟指數的變大不僅可以應對低氧，具有強大的氧承載能力；同時還可以應對高寒，保證了動物體溫的恒定[12]。

本研究中發現蕨麻豬的肝臟指數與巴馬小型豬比較沒有統計學差異，脾、腎臟指數均低于巴馬小型豬。肝臟與動物的能量消耗、代謝及產散熱密切相關。脾臟是T、B細胞定居與抗原產生免疫應答的場所，脾臟紅髓中的巨噬細胞可清除血液中的外來抗原[13]，同時可合成免疫活性物質，是哺乳動物體內重要免疫器官。蕨麻豬生活的環境溫度較低，環境中的微生物和細菌相對較少，因此被細菌微生物等感染的幾率較小，并不需要增加脾臟大小來增強免疫力。有研究顯示，溫度較低對應的食物質量和獲得性也低，同時維持較大的脾臟也需消耗很大能量[14]。先前研究顯示生理指標中蕨麻豬的紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞積壓(HCT)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCMH)均極顯著高于巴馬小香豬(P<0.01)，血小板(PLT)、紅細胞分布列寬變異系數(RDW-CV)和紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)與巴馬小香豬有顯著差異(P<0.05)；生化指標中蕨麻豬γ-谷氨?；D移酶(GGT)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CRE)極顯著高于巴馬小香豬(P<0.01)。這提示蕨麻豬具有低氧適應的生理生化表征，與巴馬小香豬比較有獨特的高原適應性[15]。

高原土生動物低氧適應性主要研究了低氧適應基因的表達及其調控機制。具有代表性的低氧適應相關基因有：低氧誘導因子-1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1)、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)。HIF-1是動物機體不同組織細胞形成缺氧耐受的分子生物學機制，可參與細胞內氧平衡狀態的調節，導致許多抗低氧的基因表達，在低氧適應機制中起到重要的作用[16]，HIF-1引發缺氧耐受的重要蛋白質分子，是介導哺乳動物細胞適應低氧環境的核轉錄因子。本研究發現蕨麻豬HIF-1α在肺、腎中的表達量明顯比巴馬小型豬高。蕨麻豬長期生活在高原地區，形成了獨特的高原適應能力，從而具有低氧適應性，伴隨著肺動脈壓的上升，肺血管對低氧的適應能力增強，對低氧反應的更具敏感性。所以，蕨麻豬HIF-1α在肺中的表達量明顯比巴馬小型豬高。至今已對藏羚羊、牦牛、藏雞、高原鼠兔等高原土生動物 HIF-1α的表達進行了大量研究，其結果顯示，HIF-1α在高原土生動物的多種組織中均有表達，并表現出顯著的組織差異性。在與低海拔對照組的比較結果顯示，高原土生動物HIF-1α在各組織中的表達量普遍增高。研究證明，藏羚羊、藏系綿羊與平原綿羊相比較，HIF-1α蛋白的表達量在肺、肝、腎組織中高于低海拔綿羊[17]，與高原鼠兔、牦牛以及本研究相一致。而蕨麻豬的肺、腎和腦組織中HIF-1α的高表達可能是通過血管擴張和新生血管生成從而增加局部組織供氧，增強了它對低氧的適應能力[18]。因此，HIF-1α組織特異性表達及表達增高可能是高原土生動物所具有的共性，它的低氧特異性表達可能是高原土生動物適應高原低氧環境的分子基礎。

在高原低氧環境，動物的缺氧代償機制會引起血管增生，VEGF是促進血管增生并增加血管通透性的關鍵因子[19]，HIF作為上游基因會調節下游的VEGF、EPO促進毛細血管增生[20]，同時VEGF也與炎癥、缺氧及高原習服等因素密切相關[21,22]。EPO基因在低氧條件下表達水平明顯增加，同時紅細胞數明顯增多[23]。一般而言，低氧刺激腎臟感受器后，腎臟加速分泌EPO并刺激骨髓加速RBC的成熟，所以血液中EPO數量會提高。此外，EPO可調節骨髓中造血干細胞向紅細胞增殖、分化和成熟，使血液中的Hb含量升高，使得機體的缺氧的代償性能力增強以提高對低氧環境的適應水平[24,25]。而本研究中EPO只在肺表達水平明顯高于巴馬小型豬，而兩者腎臟中表達量比較沒有統計學意義，其具體原因有待深入研究。有研究報道藏豬[26]EPO的表達量也高于低海拔地區的豬，這與本研究結果相一致，由此可推論EPO基因的低氧特異性高表達可能是高原豬低氧適應的分子基礎之一。我們對高原蕨麻豬與巴馬小型豬低氧相關基因VEGF、EPO及HIF-1α進行了比較，其表達量表現出明顯的組織差異性，藏羚羊的低氧相關基因表達量也顯現組織差異性[17]。

高原低氧適應性是高原醫學和生理學研究的重點，蕨麻豬生存在惡劣高寒氣候，使其具有適應高原環境的獨特的生理及生物學特性。但其低氧適應機制的研究還不夠深入，亟需利用現代分子生物學的方法，在分子水平上深入研究，發掘其高原特性及低氧適應的詳細機制，為開發研究具有高原特性的實驗動物和人類高原疾病的防治研究提供基礎理論依據。

[1] 商海濤, 魏泓. 我國小型豬品系資源狀況初淺分析 [J]. 中國實驗動物學報, 2007, 2(15): 70- 75.

[2] 景志忠, 張永興, 王自強, 等. 甘肅蕨麻豬實驗動物化利用前景 [J]. 實驗動物科學與管理, 1997, 14(4): 64-65.

[3] 楊具田, 臧榮鑫, 盧建雄. 蕨麻豬種質資源保護與開發利用 [J]. 畜牧與獸醫, 2003, 35(12): 5- 16.

[4] 李軍成, 景志忠, 余四九, 等. 蕨麻豬生長激素基因的克隆及其同源性和多態性分析 [J]. 西北農林科技大學學報增刊(自然科學版), 2006, 34(8): 201-207.

[5] 李軍成, 景志忠, 路彩霞, 等. 微衛星標記對高原蕨麻豬的遺傳多樣性研究 [J]. 中國實驗動物學報, 2007, 15(5): 355-360.

[6] 杜衛國，俞華英，施利強，等．褐家鼠的身體及內臟器官重量和含水量的初步研究 [J].中國媒介生物學及控制雜志，1997, 8(3): 161-163．

[7] Pucek Z．Seasonal and age changes in the weight of internal organs of shrews [J]．Acta Theriolog，1965, 10(26): 369-438.

[8] Schieck JO，Millar JS．Alimentary tract measurements as indicators of diets of small mammals [J]．Mammalia，1985, 49(1): 93-104．

[9] 張志強，王德華．長爪沙鼠臟器重量和腸道長度的季節性變化 [J]．獸類學報，2009, 29(3): 294-301．

[10] Consolazio CF，Johnson HG，Mataush LO， et al． Energy nitrogen and water requriements of normal adults residing at 4300 meters for 28 days [J]．Report US Army Med Res Nutrit Lab，1967, 7: 1-19．

[11] Rosenmann M，Morrison P．Maximum oxygen consumption and heat loss facilitation in small homeotherms by He-O [J]. J Physiol, 1974, 226: 490-495．

[12] 張守棟，楊傳華，林恭華, 等. 高寒草甸3種嚙齒動物內臟器官及相關性比較 [J]，四川動物, 2015, 34(3): 424-428.

[13] 邊疆暉，曹伊凡，吳雁，等．青藏高原地區根田鼠脾臟重量及遲發性超敏反應的季節性變化 [J]．獸類學報，2008, 28(3): 242-249．

[14] Liu QS，Wang DH. Effects of diet quality on phenotypic flexibility of organ size and digestive function in Mongolian gerbils (Merionesunguiculatus) [J]. J Comp Physiol B，2007, 177: 509-518.

[15] 郭曉宇, 馮小明, 陸璐, 等. 不同海拔地區兩種小型豬血液生理生化指標比較 [J]. 中國畜牧獸醫, 2015, 42(6):1490-1494.

[16] Adams JM, Difazio LT, Rolandelli RH, et al. HIF-1: a key mediator in hypoxia [J]. Acta Physiol Hung, 2009, 96(1):19-28.

[17] 劉芳, 烏仁塔娜, 馬蘭, 等. 藏羚羊低氧誘導因子1α基因的克隆與組織表達 [J]. 生理學報, 2011, 63(6): 565-573.

[18] Zhao TB, Ning HX, Zhu SS, et al. Clong of hypoxia-inducible factor 1a cDNA from a high hypoxia tolerant mammal plateau pika (Ochotona curzoniae) [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 316: 565-572.

[19] LeCouter J, Moritz D R, Li B, et al. Angiogenesis-independent endothelial protection of liver: role of VEGF-1 [J]. Science, 2003, 299(5608): 890-893.

[20] Buroker NE, Ning XH, Zhou ZN, et al. EPAS1 and EGLN1 associations with high altitude sickness in Han and Tibetan Chinese at the Qinghai-Tibetan Plateau [J]. Blood Cells Mol Dis, 2012, 49(2): 67-73.

[21] Libby P, Ridker PM, Hansson GK. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis [J]. Nature, 2011, 473(7347): 317-325.

[22] 楊曦明，謝印芝，張東祥, 等. 血管內皮細胞生長因子與高原肺水腫發病的關系 [J]. 中華醫學雜志，2000, 80(12): 931-934.

[23] Koistinen PO, Rusko H, Irjala K, et al. EPO, red cells, and serum transferrin receptor in continuous and intermittent hypoxia [J]. Med Sci Sports Exerc, 2000, 32(4): 800-804.

[24] Benderro GF, Lamanna JC. Kidney EPO expression during chronic hypoxia in aged mice [J]. Adv Exp Med Biol, 2013, 765: 9-14.

[25] 于前進. 高原紅細胞增多癥發病機制的研究進展 [J]. 國際輸血及血液學雜志, 2014, 37(1): 74-77.

[26] 韓樹鑫, 茍瀟, 楊舒黎. 動物低氧適應的生理與分子機制 [J]. 中國畜牧獸醫, 2010, 37(9): 29-34.

Comparison of organ coefficients and expression of hypoxia-related genes in the Bama and Juema minipigs

NIU Ting-xian, WANG Hong-yi,GUO Xiao-yu, LU Lu, SHEN Jian, XIAO Pan, FENG Xiao-ming

(Department of Animal Experiment, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Military Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To compare the organ coefficients and expressions of hypoxia-related genes in Bama and Juema pigs. Method Real-time quantitative PCR was used to detect the changes of hypoxia gene expressions in the heart, liver, spleen, lung, and kidney of Juema and Bama miniature pigs. Results The organ coefficients of kidney and spleen of Juema pigs were significantly lower than Bama miniature pigs (P<0.05 for both). The heart and lung coefficients of Juema pigs were significantly higher than that of Bama miniature pigs (P<0.05 for both)．The VEGF and HIF-1α expressions in the lung and kidney in Juema pigs were significantly higher than Bama pigs (P<0.05 orP<0.01). Only the EPO expression in in the lung of Juema pigs was significantly higher than that of the Bama miniature pigs (P<0.05). Conclusions These results indicate that the variation in organ coefficients may be resulted from evolutionary factors such as adaptiveness to environmental physical and energy conditions, pathogens, and energy metabolism demands, etc. in combination. Juema miniature pigs showing a significantly higher expression of hypoxia-related genes than that in Bama minipigs indicate that it has a strong plateau adaptability by higher gene expressions.

Juema minipig; Bama minipig; Organ coefficient；Hypoxia-related gene; High plateau

甘肅省自然科學基金項目(1308RJZA178)。

牛廷獻(1966-)，男，主任技師，主要研究方向：人類疾病動物模型的建立及相關研究。E-mail: niutx10000@163.com。

馮小明(1980-)，男，主管技師，主要研究方向：實驗動物質量控制及開發研究。Email: fxm8006@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0009-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.002

2016-09-22