海馬內微量注射K252a對大鼠行為學及抑郁樣經典指標的影響

孟 盼，朱 青，張秀麗，向 韻，王宇紅，楊 蕙，雷 昌

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208；3.湖南省腫瘤醫院，湖南 長沙 410013；4.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

研究報告

海馬內微量注射K252a對大鼠行為學及抑郁樣經典指標的影響

孟 盼1,2，朱 青3，張秀麗1,2，向 韻1,2，王宇紅1,2，楊 蕙4，雷 昌1,2

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208；3.湖南省腫瘤醫院，湖南 長沙 410013；4.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

目的 海馬內微量注射K252a，研究其對大鼠行為學及抑郁樣經典指標的影響，擬建立一種新型抑郁癥動物模型。方法 SD大鼠隨機分為5組，即空白對照組、假手術組、慢性應激抑郁模型組、海馬內微量注射K252a組、海馬內微量注射K252a聯合慢性應激組。采用Open field 實驗、糖水消耗實驗、Morris水迷宮測定大鼠行為學的影響，ELISA法檢測大鼠血清單胺遞質含量的變化，放射免疫法觀察大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量的變化，Western blotting觀察大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2蛋白表達的變化。結果 與空白對照組比較，CUMS組大鼠的活動量、糖水消耗量、學習記憶能力顯著降低(P<0.05或P<0.01)，HPA軸功能亢進(P<0.01)，血清單胺遞質水平降低(P<0.01)，BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達下調(P<0.01或P< 0.05)，而DMSO組上述指標差異無統計學意義；與DMSO比較，K252a組、K252a+CUMS組活動量、糖水消耗量、學習記憶能力顯著下降(P<0.01或P< 0.05)，血清單胺遞質水平下降(P<0.01或P< 0.05)，HPA軸功能顯著上升(P<0.01或P< 0.05)，海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達顯著下降(P<0.01或P< 0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠上述指標差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠上述指標差異無顯著性。結論 從行為學、血液學、分子生物學的不同角度分析表明，此模型與經典的慢性應激抑郁模型在表面效度、結構效度、功能效度上具有極大的相似性，可為病因研究和抗抑郁藥物篩選提供一個可供選擇的研究技術平臺。

抑郁癥；模型，動物；K252a；神經營養障礙

抑郁癥( depression) 是一種嚴重危害人類身心健康的全球性的疾病。隨著社會經濟的發展，生活節奏的加快，抑郁癥的發病率逐年增長，因此防治抑郁癥的創新藥物研發已成為醫藥科學發展的重要內容。近年來，抑郁癥基礎研究已經超出經典的“單胺類遞質”及“下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)軸”假說，并進行受體后機制及神經營養障礙機制研究[1]。這些研究發現細胞內信號轉導相關蛋白或靶基因對于研究抑郁癥的發病機制及抗抑郁藥物的研發具有重要的價值[2]，其中最重要的就是腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，BDNF通過酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase，TrkB)信號影響抑郁癥的病理生理結構和神經可塑性的改變已得到廣泛公認[3]。

動物模型模擬人類疾病狀態的程度以及評價方法的可靠性和準確性直接影響實驗研究結果的價值[4]。現有的抑郁癥動物模型創新性地融合了比較行為學及其經典的發病機制，然而目前尚未見基于“神經營養障礙”假說的抑郁癥相關動物模型，為該假說的深入研究及挖掘帶來了障礙。基于此，本實驗采用海馬微量注射BDNF受體阻斷劑K252a，研究其對大鼠行為學及抑郁樣經典指標的影響，并與經典的慢性溫和不可預測性應激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)抑郁模型進行比較，旨在得到一種新型的抑郁癥動物模型。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠，SPF級，240～280g, 50只，由湖南斯萊科景達動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK(湘)2012-0004，動物合格證號：HNASLKJ20140814。在光/暗周期為12h/12h(光照時間7:00～19:00)的條件下飼養于籠中，自由獲得飼料和飲水(使用許可證號：SYXK(湘)2013-0005)。

1.2 試劑

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、cAMP反應元件結合蛋白(cyclic AMP response element binding protein，CREB)一抗購自于(英國Abcam公司)；胞外調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、抑凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)一抗購自于(美國Proteintech公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋公司)；Protein marker(美國MBI Fermentas公司)；NC膜(美國Millipore公司)；羊抗兔IgG-HRP二抗(北京中杉金橋公司)；皮質醇(cortisol，CORT)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)放射免疫試劑盒(南京建成有限公司)；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)ELISA試劑盒(上海酶聯生物有限公司)。

1.3 儀器

超純水儀(德國密理博公司)；三用電熱恒溫箱(余姚市東方電工儀器廠)；開野視頻跟蹤系統、Morris 水迷宮(西班牙Panlab公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；ELX800SNT型酶標儀(美國Thermo公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；DYY-8型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠)；H6-1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)；小型濕轉儀、凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組

所有大鼠適應環境3 d，期間進行1%蔗糖水訓練，測定6 pm～9 am內大鼠1%蔗糖水攝入量。選取糖水攝入量相近的50只大鼠隨機分為5組，每組10只，即空白對照組(control)；慢性應激抑郁模型組(CUMS)；假手術組即海馬內微量注射二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)；海馬內微量注射K252a; 海馬內微量注射K252a聯合慢性應激(K252a+CUMS)。

2.2 各組處理方式及給藥[5]

空白對照組每籠5只飼養，不給予任何刺激；CUMS組大鼠單籠孤養，每天隨機給予不同刺激復制抑郁模型大鼠，包括：停食(24 h)、停水(24 h)、傾籠45℃、夾尾(1 min)、4℃冰浴(15 min)、晝夜顛倒(24 h)、噪聲(5 min)，每天隨機安排1種，平均每種刺激使用3次，共計21 d。其它各組大鼠以Bregma點為中心，鎖定大鼠海馬的位置(AP-3.8mm, ML+/-2.5mm， DV-2.5mm)，埋入套管，用套管帽擰住，以備微量注射時注射器能夠插入，各組術后給予青霉素腹腔注射3 d，留待處理后的大鼠備用。埋入套管的動物分別在實驗的第1、7、14、21天海馬內微量注射相應藥物，與此同時CUMS也在實驗的第1天開始。DMSO組大鼠海馬內微量注射1 μL DMSO；K252a組大鼠海馬內微量注射1 μL的K252a(10 μg/μL)，K252a由DMSO溶液進行配置；K252a+CUMS組在大鼠海馬內微量注射1 μL K252a(10 μg/μL)的同時聯合慢性應激。

2.3 行為學檢測

2.3.1 Open field 實驗：立方形敞箱，高40 cm，長寬80 cm，周壁、底面為黑色，用白線劃分，以大鼠在3 min 內穿越底面塊數(四爪均進入的方格方可記數)為水平(locomotor activity)得分，以直立次數為垂直活動(rearing)得分(動物雙足離開底面至動物雙足放下為一次活動)。測定動物活動量的變化。

2.3.2 糖水消耗實驗：動物單籠孤養，一個瓶裝1%蔗糖水，一個瓶裝純凈水，禁水12 h后，測定6 pm～9 am內大鼠1%蔗糖水攝入量。測定動物糖水消耗量的變化。

2.3.3 Morris 水迷宮測試：

(1)定位航行實驗：訓練試驗：分別在試驗的17～21 d進行8次航行實驗的練習，即從4個不同的象限將大鼠面向池壁放入水中，如果60 s內大鼠未爬上平臺，則將其牽引至平臺處停留20 s，在試驗的第22天進行以下實驗：每天上、下午各做1次，于平臺正對的第二象限處，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺的持續時間(escape latency)。

(2)空間搜索實驗：撤除平臺由同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄其穿越目標象限的次數(crossing target)，目標象限潛伏時間(Lat.T), 在目標區域移動的百分比D (%)。

2.4 HPA軸內分泌相關指標測定

大鼠行為學測試結束后，動物禁食24 h，10% 水合氯醛4 mL/kg腹腔麻醉，腹主動脈取血，于肝素鈉管中收集，2 500 r/min離心15 min，取血漿入1.5 mL離心管中，-80℃冰箱保存。嚴格按照放免試劑盒說明書測定血漿促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質酮(corticosterone, CORT)含量。

2.5 血清單胺遞質含量測定

大鼠行為學測試結束后，動物禁食24 h，10% 水合氯醛4 mL/kg腹腔麻醉，腹主動脈取血，于促凝管中收集，3 000 r/min離心10 min，取血清入1.5 mL離心管中，-80℃冰箱保存，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行NE、5-HT、DA的檢測。

2.6 腦標本的采集

大鼠行為學測試結束后，腹主動脈取血，然后取腦，剝離海馬組織于液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

2.7 Western-blotting 檢測相關蛋白

取海馬組織，按每mg組織5μL比例加入RIPA裂解液，冰上勻漿，4℃、12 000 r/min離心15 min后取上清液制備組織蛋白提取液，BCA法測定其蛋白含量，保存待用。按照Western-blotting實驗方法分別檢測各組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達量，其中以β-actin為內參。應用ImageJ圖像處理軟件對條帶進行掃描，測量灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達量，進行統計學分析。

2.8 數據分析

與空白組比較*P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對照組)；CUMS model(慢性應激抑郁模型組)；DMSO(假手術組即海馬內微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內微量注射K252 a聯合慢性應激)圖1 各組大鼠水平活動和垂直活動的變化±s，n=10)*P<0.05,vs. thecontrol group, **P<0.01,vs. thecontrol group; #P<0.05,vs. the DMSO group; ##P<0.01,vs. the DMSO group;▲P<0.05,vs. CUMS group,▲▲P<0.01,vs. theCUMS group; ■P<0.05, vs. thek252agroup;■■P<0.01, vs. the k252agroup.Fig.1 Changes of locomotor activity and rearing of the rats in each group

3 結果

3.1 行為學檢測結果

3.1.1 Open field 測試結果：與空白對照組比較，DMSO組大鼠的水平活動量、垂直活動量在第7、14、21天差異無顯著性，CUMS組大鼠的水平活動量、垂直活動量在第7天時開始下降(P<0.05)；與DMSO組比較，K252a、K252a+CUMS組大鼠的水平活動量、垂直活動量均在第7、14、21天下降(P<0.05或P<0.01)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的水平活動量、垂直活動量輕度下降，但差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠第21天的水平活動量、垂直活動量輕度下降，但差異無顯著性。結果見圖1，水平活動量為A，垂直活動量見B。

3.1.2 糖水消耗測試結果：與空白對照組比較，DMSO組大鼠的糖水消耗量在第7、14、21天差異無顯著性，CUMS組大鼠的糖水消耗量在第14天時開始下降(P<0.05)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的糖水消耗量均在第14、21天下降(P<0.05或P<0.01)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的糖水消耗量輕度下降，但差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠的糖水消耗量輕度下降，而差異無顯著性。結果見圖2。

與空白組比較* P<0.05, ** P<0.01；與DMSO組比較，# P<0.05, ## P<0.01；與CUMS組比較，▲P﹤0.05, ▲▲P﹤0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對照組)；CUMS model(慢性應激抑郁模型組)；DMSO(假手術組即海馬內微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內微量注射K252 a聯合慢性應激)圖2 各組大鼠糖水消耗量的變化(*P<0.05,vs control group, **P<0.01,vs. the control group; #P<0.05,vs. the DMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group; ■P<0.05, vs. the k252a group;■■P<0.01, vs. the k252a group.)Fig.2 Changes of 1% sucrose intake of the rats in each group

與空白組比較, *P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對照組)；CUMS model(慢性應激抑郁模型組)；DMSO(假手術組即海馬內微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內微量注射K252 a聯合慢性應激)圖3 Morris 水迷宮測試各組大鼠學習記憶的變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs. the DMSO group,##P<0.01,vs.the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.3 The Morris water maze test of rats in each group

3.1.3 Morris 水迷宮測試結果：在第21天時，與空白對照組比較，DMSO組大鼠的escape latency、crossing target、Lat.T、D%差異無顯著性，CUMS組大鼠的escape latency、Lat.T 顯著上升(P<0.01)，crossing target、D%下降(P<0.05)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的escape latency、Lat.T 顯著上升(P<0.01)，crossing target、D%下降(P<0.01)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠escape latency下降而差異無顯著性，crossing target、Lat.T、D%差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠的escape latency、crossing target、Lat.T、D%差異無顯著性。結果見圖3。

與空白組比較, *P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對照組)；CUMS model(慢性應激抑郁模型組)；DMSO(假手術組即海馬內微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內微量注射K252 a聯合慢性應激)圖4 各組大鼠血清NE、5-HT、DA含量變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs the DMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.4 Changes of NE, 5-HT, DA levels in the serum of rats in each group

與空白組比較*P<0.05,**P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對照組)；CUMS model(慢性應激抑郁模型組)；DMSO(假手術組即海馬內微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內微量注射K252 a聯合慢性應激)圖5 各組大鼠血漿CORT、ACTH、CRH含量變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs. the DMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.5 Changes of CORT, ACTH, and CRH levels in the plasma of rats in each group

3.2 血清單胺遞質含量的檢測結果

與空白對照組比較，DMSO組大鼠血清NE、5-HT、DA水平差異無顯著性，CUMS組大鼠血清NE、5-HT、DA水平顯著降低(P<0.01)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的血清NE、5-HT、DA水平顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠血清NE、5-HT、DA水平差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠血清NE、5-HT、DA水平差異無顯著性。結果見圖4。

3.3 血漿HPA軸相關指標的檢測結果

與空白對照組比較，DMSO組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平差異無顯著性，CUMS組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平顯著上升(P<0.01)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的血漿ACTH、CRH、CORT水平顯著上升(P<0.01或P<0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平差異無顯著性。結果見圖5。

3.4 Western-blotting檢測海馬相關蛋白表達的結果

與空白對照組比較，DMSO組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、Bcl-2的表達差異無顯著性，CUMS大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠海馬BDNF、BCL-2的表達降低而差異無顯著性，CREB、ERK1/2的表達差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達差異無顯著性。結果見圖6、7。

注：Con(空白對照組)；CU(慢性應激抑郁模型組)；D(假手術組，即海馬內微量注射二甲基亞砜)；K(海馬內微量注射K252a組); K +CU(海馬內微量注射K252a聯合慢性應激組)圖6 Western-blotting檢測海馬BDNF、CREB、BCL-2、ERK1/2的條帶圖Fig.6 Detection of hippocampal BDNF, CREB, BCL-2, and ERK1/2 of the western blot strip chart

4 討論

抑郁癥是情感性精神障礙的主要類型，是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合征，是發病率最高的精神疾病。據WHO公布的調查預計，到2020年抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾患，僅次于缺血性心臟病，將占全部疾病總負擔的6.4%[6],其對我國的國民健康及社會的危害正日益凸顯。

抑郁癥的機制研究和抗抑郁藥的新藥開發都離不開有效的抑郁癥動物模型的建立，目前常用的動物模型主要包括物理方法、化學方法、生物方法3大類，如，行為絕望模型、糖皮質激素模型、單胺遞質耗竭模型等；其中，CUMS模型可較好地模擬抑郁病癥，并用來探究各種病理、病因、分子機制等，是目前抑郁癥研究中應用較普遍的一種模型[7]。但是上述模型的復制大部分是基于抑郁癥表觀行為學的改變或“單胺類遞質”及“HPA軸”假說，隨著基礎研究的深入，抑郁癥的發病機制已拓展至“神經營養”假說，且其或將成為國內外研究的熱點，因此開發一種基于該假說的新模型并在此基礎上開展研究具有重要的價值。

與空白組比較*P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對照組)；CUMS model(慢性應激抑郁模型組)；DMSO(假手術組即海馬內微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內微量注射K252 a聯合慢性應激)圖7 各組大鼠海馬相關蛋白表達的含量變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs. rheDMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.7 Protein levels in the rat hippocampus of each group.

行為學評價可以重現抑郁患者行為學的特征，在某種程度上可以很好的評價模型的表征改變。快感缺失是抑郁癥的核心癥狀，主要是以糖水偏好的程度作為參考指標[8]。自主、探究活動下降及緊張度增高是抑郁癥的重要表征，水迷宮法是一種關于場景和事件的學習記憶模式，亦是一種空間辨別性學習記憶的經典檢測方法[9]。本文結果表明，海馬內微量注射K252a可模擬抑郁狀態下的行為學改變，表現在活動量、糖水消耗量、學習記憶能力顯著下降，故從表面效度而言與臨床抑郁癥患者表征的變化具有一致性。

“單胺遞質假說”和“神經內分泌即說”是抑郁癥發病機制研究的核心假說。患者體內突觸間隙5-HT、DA、NE含量的降低可以導致抑郁癥的發生，而抑郁癥患者機體必然存在5-HT、DA、NE含量的耗竭[10]。抑郁癥患者血漿皮質醇分泌過多，且分泌的晝夜節律亦有變化，即抑郁癥患者存在HPA軸功能障礙[11]。本文結果表明，海馬內微量注射K252a可導致大鼠血清5-HT、DA、NE含量下降，血漿CRH、ACTH、CORT含量升高，即HPA軸功能高亢。故從結構效度上而言與抑郁癥患者情緒障礙的生理學基礎，即神經生物學機制的變化相同。

抑郁癥“神經營養”假說認為BDNF含量的降低會使神經元營養障礙，導致海馬損傷，進而誘發抑郁癥。BDNF是該假說的核心，而BDNF主要是通過Trk B調節其下游胞內信號傳導變化。神經元BDNF/TrkB信號的變化可導致抑郁癥的發生[12]。BDNF通過激活TrkB和絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導級聯影響細胞功能，其中ERK1/2是MAPK信號級聯中重要的蛋白，海馬內ERK1/2水平的降低參與抑郁癥的發生[13]。BDNF/TrkB信號上游可受CREB的影響，下游可以調節海馬神經元凋亡[14]。CREB 可調節腦內多種基因的轉錄，參與神經元的興奮、發育、凋亡以及突觸可塑性等多個神經過程[15]。Bcl-2是神經元凋亡的關鍵蛋白，其在海馬細胞凋亡損傷過程中起著重要作用[16]。本文結果表明，海馬內微量注射K252a可以導致模型大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達降低，提示該模型海馬神經元損傷，故從功能效度而言與抑郁癥“神經營養障礙”的胞內信號轉導機制及神經元損傷相符。

綜上，海馬內微量注射K252a可在行為、血液、分子生物學指標等方面模擬CUMS大鼠的變化，并可分別從表面效度、結構效度、功能效度等不同方面映證模型的可靠性，該模型的建立可為抑郁癥的基礎研究及抗抑郁藥物的篩選和研制提供一個良好的技術平臺。

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(致謝：感謝中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室老師的協助及其在技術方面的支撐，并感謝實驗室在儀器方面的幫助。在此一并致謝！)

Changes of behavior and depression-like classic indicators after hippocampal microinjection of K252a

MENG Pan1,2, ZHU Qing3, ZHANG Xiu-li1,2, XIANG Yun1,2, WANG Yu-hong1,2, Yang Hui4, LEI Chang1,2

(1. Hunan University of Traditional Chinese medicine, Changsha, 410208,China; 2.Training Base,Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry, Changsha, 410208; 3. Hunan Provincial Tumor Hospital, Changsha 410013;4.First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007)

Objective To study the changes of behavior and depression-like classic indicators after hippocampal microinjection of K252a, and to establish a new animal model of depression. Methods SD rats were randomly divided into five groups, namely the control group, sham group, chronic stress depression model group, hippocampal of K252a microinjection group, and hippocampal microinjection K252a plus chronic stress group. Open field experiments, sucrose consumption test, and Morris water maze behavioral assay were used to assess the behavioral changes in the rats. ELISA was used to detect the plasma monoamine neurotransmitter, radioimmunoassay was used to determine the plasma CRH, ACTH, CORT contents, and western-blotting was performed to observe the protein expression of BDNF, CREB, ERK1/2, and BCL-2 in the hippocampus. Results Compared with the control group, the amount of activity, sugar consumption, learning and memory abilities were decreased(P<0.05 orP<0.01), also the serum monoamine neurotransmitters were decreased (P<0.01), HPA axis function was improved (P<0.01), and the expression of BDNF, CREB, ERK1/2, BCL-2 decreased in the CUMS group(P<0.05 orP<0.01), but there was no significant difference in the DMSO group.Compared with the DMSO group, the activity, consumption of sucrose, learning and memory ability were significantly decreased(P<0.05 orP<0.01),while the HPA axis function was increased (P<0.05 orP<0.01),the serum monoamine neurotransmitters decreased(P<0.05 orP<0.01), and the BDNF, CREB, ERK1/2, BCL-2 expressions in the hypocampus were significantly decreased(P<0.05 orP<0.01) in the K252a group and K252a + CUMS group. Compared with the CUMS group,the K252a group and K252a + CUMS group did not show significant changes in these parameters. Compared with the K252a group, these indicators were not significantly changed in the K252a + CUMS group. Conclusions The results of behavior, hematology, and molecular biology analysis show that this model has a great similarity to the classical model of CUMS in surface validity, construct validity, and functional validity. It may provide an alternative investigative technology platform for basic research and antidepressant drug screening.

Depression; Models, animal; K252a;Neurotrophic disorders

國家自然科學基金青年項目(81403387);湖南省教育廳一般項目(14C0862;15C1038);湖南省科技廳重點項目(2015DK3003);中醫內科學省部共建教育部重點實驗室開放基金(ZYNK201503)。

孟盼(1987-)，女，博士，主要從事神經精神疾病的機制研究及中醫藥防治。E-mail:mengpan0822@163.com。

王宇紅(1965-)，女，研究員，博士研究生導師，研究方向：中藥神經藥理。E-mail: wyh107@126.com。

【文獻標識碼】 A 【文章編號】1671-7856(2017) 04-0026-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.005

2016-11-23