利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除小鼠黑色素瘤細(xì)胞系MATP基因的初步研究

殷慧慧，李 丹，李 鈺，孫 菲，董施施，孔江峰，王洪寶，曾 林，法云智，孫兆增

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071)

研究報告

利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除小鼠黑色素瘤細(xì)胞系MATP基因的初步研究

殷慧慧，李 丹，李 鈺，孫 菲，董施施，孔江峰，王洪寶，曾 林，法云智，孫兆增

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071)

目的 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除小鼠黑色素瘤細(xì)胞系的MATP基因，為MATP基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。方法 利用http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站，設(shè)計針對MATP的特異性引物，并將引物鏈接到pCAS9/gRNA1載體。將陽性載體轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10，利用無限稀釋的方法獲得轉(zhuǎn)染后的單克隆細(xì)胞株。提取不同細(xì)胞株的基因組，通過測序的方法進(jìn)一步篩選出發(fā)生MATP基因切割的細(xì)胞株，并利用Western-blot的方法驗證MATP的表達(dá)情況。結(jié)果 成功獲得了3株MATP基因敲除的細(xì)胞株，Western-blot結(jié)果表明，該細(xì)胞株不表達(dá)MATP蛋白。結(jié)論 利用pCAS9/gRNA1載體，可以實現(xiàn)B16F10細(xì)胞系MATP基因的敲除。

CRISPR-Cas9; 黑色素瘤細(xì)胞;MATP; 研究

眼皮膚性白化病是由于不同黑色素合成或轉(zhuǎn)運相關(guān)基因突變而導(dǎo)致的具有相同或相似臨床癥狀的一類遺傳性疾病的總稱[1]，根據(jù)涉及基因的不同，OCA(oculocutaneous albinism)可以分為4個常見類型，即OCA1-OCA4[2]。OCA4是一種發(fā)現(xiàn)較晚的眼皮膚白化病，它是由編碼膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白MATP(membrane-associated transporter protein，MATP)基因突變而導(dǎo)致的白化類型[3]。MATP基因為膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白，該基因定位于5號染色體，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，共有530個氨基酸殘基[4]。通過分析膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)，推測其可能存在轉(zhuǎn)運功能。

CRISPR/Cas9是一種來源于細(xì)菌的由RNA 指導(dǎo) Cas9蛋白對基因進(jìn)行編輯和修飾的新技術(shù)[5]。這種核酸酶活性僅僅需要一種非編碼RNA (sgRNA) 介導(dǎo)下即可實現(xiàn)定向基因打靶， CRISPR/Cas9系統(tǒng)是相對于 ZFNs 和TALENs 更為簡便、快速的基因組編輯技術(shù)[6]，在細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞以及斑馬魚、小鼠、大鼠等都表現(xiàn)出很強的基因組編輯活性[7, 8]。因此本研究擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)，實現(xiàn)對小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10細(xì)胞系MATP基因的敲除。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：pCAS9/gRNA1質(zhì)粒，由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司提供。常用的分子生物學(xué)試劑和細(xì)胞培養(yǎng)液等分別購自TAKARA、NEB和GE Healthcare等公司。MATP抗體(ab57270)，購自Abcam公司；Beta actin抗體(TA-09)，購自中山金橋公司。

1.1.2 菌種及細(xì)胞株：實驗中所用的大腸桿菌感受態(tài) DH5α和小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10，由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 MATP特異性引物的設(shè)計：根據(jù)MATP第1個外顯子的序列，利用http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站設(shè)計兩對特異性引物(Score值在80以上)。根據(jù)pCAS9/gRNA1載體的要求，設(shè)計兩對引物，MATP1上下游引物序列分別為：5-acaccgCCGAGAGTTT TGCTATGCGGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc cgtt-3(其中大寫字母為MATP特異性序列，其余為載體序列，下同。)和5-aacggactagccttattttaacttgct atttctagctctaaaacCCGCATAGCAAAACT CTCGGcggtgt-3；MATP2上下游引物序列分別為：5-acaccgTTAGCC GAGGATTGCCCCTTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg ctagtccgtt-3和5-aacggactagccttattttaacttgctatttctagctcta aaacAAGGGGCAATCCTCGGCTAAcggtgt-3。

1.2.2 pCAS9/gRNA1-MATP載體的構(gòu)建：將MATP1上和MATP1下以及MATP2上和MATP2下兩對引物分別進(jìn)行退火，合成雙鏈寡核苷酸。利用EcoRV將2μg pCAS9/gRNA1質(zhì)粒(圖1)線性化，回收線性化的質(zhì)粒并定量。用水將退火后的雙鏈寡核苷酸稀釋100倍，利用T4連接酶將上述2種寡核苷酸連接到線性化的pCAS9/gRNA1質(zhì)粒。

1.2.3 pCAS9/gRNA1-MATP載體轉(zhuǎn)化和陽性克隆的篩選：連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取多個菌落至氨芐抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。鑒定所用的引物，gRNA-F：GACTATC ATATGCTTACCGTAACT，gRNA-R：GACTATCATAT GCTTACCGTAACT。直接利用菌液PCR的方法進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒分別命名為：pCAS9/gRNA1-MATP1和pCAS9/gRNA1-MATP2。

1.2.4 pCAS9 /gRNA1-MATP1和pCAS9/gRNA1-MATP2兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：將B16F10細(xì)胞傳代至6孔培養(yǎng)板，在細(xì)胞密度達(dá)到80% 時，利用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，兩種質(zhì)粒的用量都是1 μg。換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，利用胰酶進(jìn)行消化。收獲細(xì)胞后，按照107倍稀釋細(xì)胞，并接種到96孔板。由于B16F10細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的黑色素，在顯微鏡下能夠明顯觀察到黑色素的聚集，并且在細(xì)胞濃度較高時，培養(yǎng)液染色很快會發(fā)生變化。因此利用B16F10細(xì)胞的這種特性，可以篩選到與野生細(xì)胞株不同的單克隆細(xì)胞株。篩選到單克隆細(xì)胞后，提取細(xì)胞的基因組，利用PCR的方法擴增MATP基因第1個外顯子的序列，通過測序的方法進(jìn)一步確定MATP基因的敲除情況。

1.2.4MATP基因敲除細(xì)胞株中MATP蛋白的表達(dá)情況檢測：利用Western-blot實驗檢測MATP蛋白的表達(dá)情況：收取的細(xì)胞沉淀中加入RIPA裂解液裂解，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。恒流250 mA轉(zhuǎn)膜后，利用MATP抗體檢測MATP蛋白的表達(dá)情況，β-actin作為實驗的陽性對照。

2 實驗結(jié)果

2.1 pCAS9 /gRNA1-MATP1和pCAS9/gRNA1-MATP2質(zhì)粒的篩選結(jié)果

挑取24個轉(zhuǎn)化pCAS9 /gRNA1-MATP1質(zhì)粒的單菌落，培養(yǎng)后利用菌液PCR篩選陽性克隆，共篩選到5個陽性克隆，見圖2。

挑取23個轉(zhuǎn)化pCAS9 /gRNA1-MATP2,質(zhì)粒的單菌落，共篩選到8個陽性克隆，見圖3。從陽性菌株中提取質(zhì)粒，送測序公司進(jìn)行序列測定。

2.2 B16F10細(xì)胞MATP基因敲除情況分析結(jié)果

通過黑色素的產(chǎn)生和培養(yǎng)液的變化情況，共篩選到8株疑似MATP基因敲除的細(xì)胞克隆。提取這8株細(xì)胞的基因組，利用PCR的方法獲得MATP基因第1個外顯子的序列，分別進(jìn)行了測序。其中3株細(xì)胞株發(fā)生了MATP基因的移碼突變，其中2個細(xì)胞株為編碼框35位的C堿基缺失，1個細(xì)胞株為36位的G堿基缺失。

2.3MATP基因敲除細(xì)胞株MATP蛋白的表達(dá)情況檢測結(jié)果

利用Western-blot檢測結(jié)果表明，發(fā)生了MATP基因移碼突變的3株細(xì)胞株，檢測不到MATP蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖4，說明成功實現(xiàn)了B16F10細(xì)胞MATP基因的敲除。

圖1 pCAS9/gRNA1質(zhì)粒示意圖Fig.1 Diagram of the pCAS9/gRNA1 plasmid

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；9,12,18,19,22為陽性；其余為陰性圖2 pCAS9 /gRNA1-MATP1質(zhì)粒陽性菌株的篩選Fig.2 Screening of pCAS9/gRNA1-MATP1 plasmid-positive strains. M: DNA molecular weight markers; 9, 12, 18, 19, and 22 are positive. The others are negative.

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；4, 6, 9, 11, 16, 17, 19, 20為陽性；其余為陰性圖3 pCAS9 /gRNA1-MATP2質(zhì)粒陽性菌株的篩選Fig.3 Screening of pCAS9/gRNA1-MATP2 plasmid-positive strains. M: DNA molecular weight markers; 4, 6, 9, 11, 16, 17, 19, and 20 are positive; The others are negative.

1,2,3為MATP基因移碼突變的3株細(xì)胞株，4,5,6為野生細(xì)胞株圖4 MATP蛋白表達(dá)的Western-blot檢測結(jié)果Fig.4 Western-blot detection of the MATP protein expression. 1, 2, 3 are the cell lines with the frameshift mutation of MATP gene; 4, 5, 6 are the wild-type cell lines.

3 討論

由于其具有特異性高，分子構(gòu)建簡單，流程短的特點,近年來CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得了快速發(fā)展。使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行基因敲除需要兩個關(guān)鍵因素，首先是有效的 sgRNA 引導(dǎo)序列，再就是Cas9蛋白的存在[9]。因此在利用CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行基因敲除，需要兩個質(zhì)粒，并且需要將sgRNA序列和Cas9序列在體外轉(zhuǎn)錄成RNA。而pCAS9/gRNA1質(zhì)粒，在同一個質(zhì)粒中表達(dá)Cas9蛋白和sgRNA，實現(xiàn)單獨轉(zhuǎn)染一個質(zhì)粒即可產(chǎn)生基因敲除效果，操作更為簡單，并且在哺乳動物細(xì)胞中具有較高的敲除效率。本實驗利用該pCAS9 /gRNA1質(zhì)粒，成功實現(xiàn)了B16F10細(xì)胞MATP基因的敲除，進(jìn)一步證實單一質(zhì)粒敲除的有效性。

B16F10細(xì)胞是小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞,在體外培養(yǎng)時可以產(chǎn)生大量的黑色素[10]。細(xì)胞產(chǎn)生的大量黑色素可以在顯微鏡下清楚的觀察到，并且黑色素的產(chǎn)生可以使培養(yǎng)基很快變色，這種特點在在研究黑色素形成相關(guān)基因尤其有用[11]。 B16F10細(xì)胞的MATP基因敲除后，黑色素的形成能力受到較大的影響，因此通過細(xì)胞黑色素形成的差異，能夠比較容易的篩選到基因敲除的細(xì)胞株。本實驗利用這個特點篩選到8個疑似MATP基因敲除細(xì)胞株，通過基因克隆測序的方法證實確有3株細(xì)胞株發(fā)生了MATP基因的敲除。該實驗為黑色素相關(guān)基因的功能研究提供了一些有用的參考。

[1] Lekalakala PT, Khammissa RA, Kramer B, et al. Oculocutaneous albinism and squamous cell carcinoma of the skin of the head and neck in Sub-Saharan Africa [J]. J Skin Cancer, 2015, 2015(6). Article ID 167847.

[2] Shakil M, Ullah MI, Hussain S, et al. Homozygosity mapping of a consanguineous Pakistani family affected with oculocutaneous albinism to tyrosinase gene [J]. Int J Ophthalmol, 2016, 9(5): 794-796.

[3] 吳立娟, 彭曉霞, 梁小云, 等. 眼皮膚白化病遺傳基因研究進(jìn)展 [J]. 廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2006, 34(4): 58-61.

[4] Kamaraj B, Purohit R. Mutational analysis on membrane associated transporter protein (MATP) and their structural consequences in oculocutaeous albinism type 4 (OCA4) — A molecular dynamics approach [J]. J Cell Biochem, 2016, 117(11): 2608-2619.

[5] Ding Y, Hong L, Chen LL, et al. Recent advances in genome editing using CRISPR/Cas9 [J]. Front Plant Sci, 2016, 7: 703.

[6] He Z, Proudfoot C, Whitelaw CBA, et al. Comparison of CRISPR/Cas9 and TALENs on editing an integrated EGFP gene in the genome of HEK293FT cells [J]. Springerplus, 2016, 5(1): 1-12.

[7] Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, et al. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9 [J]. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res, 2016, 1863(9): 2333-2344.

[8] 馬元武, 張連峰. 利用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)快速、經(jīng)濟的大鼠條件基因敲除技術(shù) [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(3): 66-66.

[9] 周金偉，徐綺嬪，姚婧，等.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及其在動物基因組定點修飾中的應(yīng)用[J].遺傳，2015，37(10)：1011-1020.

[10] Baishya R, Nayak D K, Kumar D, et al. Ursolic acid loaded PLGA nanoparticles: in vitro and in vivo evaluation to explore tumor targeting ability on B16F10 melanoma cell lines [J]. Pharmaceut Res, 2016, 33(11): 2691-703.

[11] Shin DH, Kim OH, Jun HS, et al. Inhibitory effect of capsaicin on B16-F10 melanoma cell migration via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/Rac1 signal pathway [J]. Exp Mol Med, 2008, 40(5): 486-494.

A preliminary study on theMATPgene knockout in a mouse melanoma cell line using CRISPR-Cas9 system

YIN Hui-hui, LI Dan, Li Yu, SUN Fei, DONG Shi-shi, KONG Jiang-feng,WANG Hong-bao, ZENG Lin, FA Yun-zhi, SUN Zhao-zeng

(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)

Objective To knockout theMATPgene of mouse melanoma cell line B16F10 using CRISPR/Cas9 system, and to lay foundation for the functional study ofMATPgene.Methods Specific primers ofMATPwere designed according to the report in http://crispr.mit.edu/ website. The primers were linked to pCAS9/gRNA1 vector. Then the positive vector was transfected into mouse melanoma B16F10 cells, and monoclonal cell lines were obtained by the infinite dilution method. After the genomes of different monoclonal cell lines were extracted and sequenced, the cell lines withMATPgene cleavage were screened, and the expression ofMATPin these cell lines was verified by Western-blot analysis. Results ThreeMATPgene knockout cell lines were successfully obtained. The western-blot results showed that the cell lines did not express MATP protein. Conclusions The knockout ofMATPgene in B16F10 cell line can be successfully achieved using the pCAS9/gRNA1 vector.

CRISPR-Cas9; Melanoma cells;MATP; Mouse melanoma cell lines

國家自然科學(xué)基金31272387，全軍實驗動物專項課題SYDW〔2014〕006。

殷慧慧(1990-)女，碩士研究生，研究方向為實驗動物疾病模型。E-mail: yinhuhui2014@163.com。

孫兆增(1977-)男，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：實驗動物疾病模型。E-mail: laxszz@aliyun.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0052-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.009

2016-12-08