母嬰分離應激對rd新生小鼠行為的影響

張傳領， 邸 桐，王文婧，牛麗麗，肖 瑞

(1. 內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010110； 2. 內蒙古醫科大學分子病理學重點實驗室，呼和浩特 010110；3. 沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016)

研究報告

母嬰分離應激對rd新生小鼠行為的影響

張傳領1， 邸 桐2，王文婧3，牛麗麗2，肖 瑞2

(1. 內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010110； 2. 內蒙古醫科大學分子病理學重點實驗室，呼和浩特 010110；3. 沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016)

目的 rd小鼠是一種出生1周左右自發致盲的遺傳性視網膜變性小鼠。通過母嬰分離應激實驗，檢測其對rd新生小鼠的焦慮樣和抑郁樣行為的影響，初步評價rd小鼠能否成為眼部疾病與焦慮抑郁研究新的模型。方法 將出生第1天的rd小鼠分為母嬰分離組(n=9)和對照組(n=9)。母嬰分離組每天與母鼠分離4 h，共分離28 d。從第29天開始行為測試實驗，通過Smart3動物行為跟蹤軟件檢測母嬰分離組和對照組在曠場實驗和十字高架實驗中的焦慮樣行為，在強迫游泳實驗和懸尾實驗中的抑郁樣行為。結果 在曠場實驗中，母嬰分離組在曠場中心的時間比例(0.88%)和運動距離(28.17±5.65)cm均明顯少于對照組(2.61%，109.9±9.79 cm；P=0.04,P=0.001);在十字高架實驗中，母嬰分離組在開放臂的時間(40.64±4.13)s明顯少于對照組(91.73±11.26 s，P<0.01); 在強迫游泳實驗中，母嬰分離組的不動時間(126.5±10.22)s明顯多于對照組(77.75±16.83 s，P=0.02)；在懸尾實驗中，母嬰分離組的不動時間(21.56±6.83)s多于對照組(7.37±3.22 s，P=0.03)。 結論 rd小鼠母嬰分離28 d應激，能夠明顯增加rd小鼠的焦慮樣行為和抑郁樣行為。

rd小鼠；母嬰分離；開放場實驗；十字高架實驗；強迫游泳實驗；懸尾實驗

人類生活早期應激(early life stress, ELS)，是誘發焦慮、抑郁等多種精神疾病的重要風險因素。流行病學的研究結果表明那些在身體和情感上受到傷害兒童在發育過程中具有很高的焦慮障礙[1,2]和抑郁癥風險[3]。ELS動物模型已經廣泛的應用于研究精神類疾病機理中。動物研究顯示，母嬰分離導致動物行為異常而出現焦慮和抑郁樣反應[4]。目前主要有兩種常用的產后處理方法來模擬早期生活應激，早期剝奪(early deprivation (ED)和母子分離(maternal separation, MS)。母子分離方式包括每天將新生動物和其母親短時間分離1 h[5, 6]和3～6 h的長時間分離[7]持續1～3周。母子分離應激在豬、豚鼠和鳥類中都有所使用，最廣泛的是應用在大鼠和小鼠上。經歷MS 對實驗動物成年后的神經、內分泌、免疫系統以及精神行為具有廣泛的影響。生命早期不良應激對神經發育的影響逐步引起關注，母嬰分離逐漸成為了研究精神類疾病的有效工具，特別是研究生命早期不良應激對抑郁癥的病理過程的影響正逐步成為研究熱點[8]。國內外對于母子分離實驗研究主要使用的正常大小鼠，極少用患有某種生理疾病的老鼠進行實驗。Rd小鼠作為一種在哺乳期就因視網膜退化而失明的小鼠，在研究母嬰分離應激中尚未有相關研究報道。中國是全世界盲人最多的國家，據世界衛生組織2010統計，中國盲人(blind)824.8萬，低視力(low vision)6727.4萬，視力殘疾(visual impairment)是兩者的總和7551.2萬[9]。本實驗試圖為從小致盲人群在外界應激作用下行為變化提供基礎的實驗結果。為盲人抑郁癥治療和護理提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料

rd小鼠, rd1 (PDE6brd1; CBA/J) 小鼠購自南京大學模式生物所(動物生產許可證號：SCXK(蘇)2015-0001；于內蒙古醫科大學分子病理學重點實驗室配種飼養,循環光照(光照12 h,黑暗12 h), 環境溫度約為25℃,無菌環境下飼養。Smart3動物行為跟蹤系統(Pan lab,西班牙), 敞箱(自制，邊長45 cm，高50 cm)，十字高架(自制，臂長66 cm，高50 cm)，燒杯(1 000 mL)，懸尾裝置(自制)，攝像機(索尼，日本)。

1.2 方法

1.2.1 母子分離應激設計：雌雄Rd成年鼠2∶1 合籠交配，待雌鼠懷孕后單籠飼養。生產后選9只新生rd鼠(5只雄性，4只雌性)實驗組即母嬰分離組(ms)，從出生第1天起(P1)，每天上午(9:00～13:00)與母鼠分離4 h，之后放回母鼠身邊。共分離28 d。分離期間幼鼠禁食禁水。對照組新生小鼠9只不做任何處理。母嬰分離應激結束后即第29天開始進行行為學測試。

1.2.2 曠場實驗(open field test, OFT):將待測rd小鼠放入測試房間適應1 h，后將rd小鼠放入曠場反應箱的中央部位。用攝像機記錄下rd小鼠5 min內在曠場內的活動情況。后用Smart3小動物識別跟蹤系統的曠場實驗模塊進行跟蹤分析。計算rd小鼠在測試時間內運動總路程(total distance traveled)，中央區域總路程，在中央區域(center zone)停留時間與總時間的百分比等參數。

1.2.3 十字高架迷宮測試(elevated plus-maze test，EPMT)：將待測rd小鼠放入測試房間適應1 h。后將 rd小鼠放入十字高架中心區(central area),頭部面對開放臂。有攝像機記錄下rd小鼠5 min內在十字高架內的活動情況，用Smart3小動物識別跟蹤系統的十字高架模塊進行跟蹤分析rd小鼠在測試時間內進入開臂和閉臂的次數和在兩臂滯留時間。

1.2.4 強迫游泳實驗(forced swim test, FST):將待測rd小鼠放入測試房間適應1 h。后將 rd小鼠放入1000 mL大燒杯中，水溫為26℃，水深為12 cm。有攝像機記錄下6 min內rd小鼠燒杯內的活動情況， 然后用Smart3小動物識別跟蹤系統的強迫游泳模塊進行跟蹤分析不動時間。

1.2.5 懸尾實驗(tail suspension test, TST):將待測rd小鼠放入測試房間適應1 h。后將 rd小鼠尾部后2 cm處用膠帶固定，懸掛于支架上，計時6 min后停止。用Smart3小動物識別跟蹤系統的懸尾實驗模塊進行跟蹤分析rd小鼠在測試時間內的不動時間進行統計。

1.2.6 數據分析:測定值用均數±標準差( Mean ±s) 表示。采用GraphPad Prism 6軟件分析，組間比較采用t檢驗。以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曠場實驗

母嬰分離組(MS)組平均總運動路程為2106±249.7 cm對照組(control)平均總運動路程為2797±211.9 cm。母子分離組走過的總路程比對照組短，兩組統計學上差異有顯著性(P=0.049)。MS組和對照組在周圍區域運動路程分別為(2077±247.4) cm和(2687±206.0) cm，兩組統計學上差異沒有顯著性(P=0.074)。而在中間區域運動路程兩組差異有非常顯著性(P<0.0001)，MS組的平均運動距離為28.17±5.65 cm，而對照組在中間區域的平均運動距離為(109.9±9.79) cm(圖1)。從小鼠在中間區域停留時間占總時間的百分比看， MS組為0.88%，對照組為2.61%，兩組差別有顯著性(P=0.0015)(圖2)。

2.2 十字高架實驗

在rd小鼠進入開放臂次數方面， MS組(13.80±2.51)次與對照組(12.20±1.11)次差異沒有顯著性(P=0.78)(圖3)。而rd小鼠在開放臂的時間來看，ms組(40.64±4.13)s明顯少于對照組(91.73±11.26)s(圖4)。

2.3 強迫游泳

母嬰分離組在強迫游泳實驗中的平均不動時間為(126.5±10.22) s，對照組為(77.75±16.83) s，母嬰分離組明顯多于實驗組(P=0.02)(圖5)。

2.4 懸尾實驗

母嬰分離組在強迫游泳實驗中的平均不動時間為(21.56±6.83) s，對照組為(7.37±3.22) s，母嬰分離組明顯多于實驗組(P=0.03)(圖6)。

圖1 rd小鼠在開放場中的運動距離比較Fig.1 Traveled distance of rd mice in open field test

圖2 母嬰分離組(MS)與對照組(control)在開放場中心區停留時間比例Fig.2 Time ratio of center zone vs total zone of the two groups mice in open field test

圖3 母嬰分離組(MS)與對照組(control)小鼠在十字高架中進入開放臂次數Fig.3 Entries in the open arms between MS and control groups

圖4 母嬰分離組(MS)與對照組(control)小鼠在開放臂停留時間Fig.4 Time in open arms between the MS and control groups

圖5 母嬰分離組(MS)與對照組(control)強迫游泳中不動時間Fig.5 Immobility time between the MS and control groups in force swim test

圖6 實驗組(MS)與對照組(control)在懸尾實驗中不動時間Fig.6 Immobility time between the MS and control groups in tail suspend test

3 討論

曠場實驗又稱敞箱實驗，是測試嚙齒類動物焦慮樣行為的常用的方法，曠場區域要比鼠籠大很多，嚙齒類動物天生傾向于靠近有壁的地方活動，而避免在中心不可預測的地方活動。測量它們在中心區域的探究行為是和焦慮相關的的指標[10,11]。本實驗在rd小鼠在周邊路程在沒有顯著性差異情況下，停留在中心區域的的時間，中心區域運動距離和總運動距離母嬰分離組明顯少于對照組，從開放場結果看，rd小鼠母嬰分離后焦慮樣行為更明顯。

十字高架實驗是評估嚙齒類動物焦慮樣反應的很受歡迎的方法。十字高架有一對閉合臂和一對開放臂構成，高架離地面50 cm，實驗利用小鼠對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突來考察小鼠的焦慮狀態。用小鼠在開放臂的次數和時間來衡量其焦慮狀態[12,13]。本實驗結果表明，母子分離組進入開放臂的時間要比對照組要少，說明母子分離讓rd小鼠比正常組小鼠表現出更多的焦慮樣行為。

強迫游泳實驗是進行抗抑郁藥初步篩選和判斷嚙齒類動物抑郁樣行為的有效的測試實驗，實驗將實驗對象放到灌水的圓柱體中，造成不可逃脫的環境，以測試時間內嚙齒類動物不動時間作為指標[14]。本實驗在強迫游泳的結果中顯示母子分離rd小鼠28 d，增加了rd小鼠的抑郁樣行為。

懸尾實驗是基于小鼠被懸尾后，在一種短期的無法逃脫的有害環境中，產生絕望，表現出靜止不動。該實驗用于評估小鼠的抑郁樣行為[15,16]。本實驗結果顯示母子分離組rd小鼠較對照組抑郁樣行為明顯增加。

臨床和流行病學調查顯示失明和眼部疾病與抑郁癥和焦慮有廣泛的聯系[17,18]。如何進行動物學實驗方面的研究一直沒有合適的動物品系。Rd小鼠具有視網膜變性基因病變，在出生后第7天左右視網膜退化導致小鼠失明。而國內外關于母子分離實驗選取生理正常的大小鼠進行，其結果在不同品種大小鼠之間結果也缺乏穩定的一致性[19]。本實驗結果顯示遺傳性致盲小鼠在母子分離應激中也表現出更高的焦慮樣和抑郁樣行為。rd小鼠能否成為研究眼部疾病與焦慮和抑郁的新的動物模型，需要在機制上進一步在研究。

[1] Felitti VJ, Anda RF, Nordenberg D, Williamson DF, et al. Relationship of childhood abuse and household dysfunction to many of the leading causes of death in adults. The Adverse Childhood Experiences (ACE) Study [J]. Am J Prev Med. 1998,14(4): 245-258.

[2] Gibb BE, Chelminski I, Zimmerman M. Childhood emotional, physical, and sexual abuse, and diagnoses of depressive and anxiety disorders in adult psychiatric outpatients [J]. Depress Anxiety, 2007，24(4): 256-267.

[3] Springer KW, Sheridan J, Kuo D, et al. Long-term physical and mental health consequences of childhood physical abuse: results from a large population-based sample of men and women[J]. Child Abuse Negl, 2007, 31(5): 517-530.

[4] Uys JD. Marais L, Faure J, et al. Developmental trauma is associated with behavioral hyperarousal，altered HPA axis activity，and decreased hippocampal neurotrophin expression in the adult rat [J]. Ann N Y Acad Sci，2006,1071: 542-546.

[5] Wilber AA, Southwood CJ, Sokoloff G, et al. Neonatal maternal separation alters adult eyeblink conditioning and glucocorticoid receptor expression in the interpositus nucleus of the cerebellum [J]. Dev Neurobiol, 2007,67(13): 1751-1764.

[6] Wilber AA, Wellman CL. Neonatal maternal separation-induced changes in glucocorticoid receptor expression in posterior interpositus interneurons but not projection neurons predict deficits in adult eyeblink conditioning [J]. Neurosci Lett, 2009, 460, 214-218.460: 214-218.

[7] Lippmann M, Bress A, Nemeroff CB, et al. Long-term behavioural and molecular alterations associated with maternal separation in rats [J]. Eur J Neurosci. 2007,25(10): 3091-3098.

[8] 林澤斯,王洪琦.腸易激綜合征母嬰分離模型應用進展[J].中國實驗動物學報, 2015, 23(4): 434-439.

[9] Pascolini D, Mariotti SP. Global estimates of visual impairment: 2010 [J]. Br J Ophthalmol. 2012, 96(5): 614-618.

[10] Prut L, Belzung C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review [J]. Eur J Pharmacol, 2003, 463: 3-33.

[11] Stanford SC. The open field test: reinventing the wheel [J]. J Psychopharmacol, 2007, 21: 134-135.

[12] Pellow S, Chopin P, File SE, et al. Validation of open: closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat [J]. J Neurosci Methods,1985,14: 149-167.

[13] Carobrez AP, Bertoglio LJ. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on [J]. Neurosci Biobehav Rev, 2005, 29(8): 1193-1205.

[14] Adem C, David T, Todd DG. The mouse forced swim test [J]. J Vis Exp, 2012, (59): 36-38.

[15] Steru L, Chermat R, Thierry B, et al. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice [J]. Psychopharmacology (Berl), 1985, 85(3): 367-370.

[16] John FC, Cedric M, Annick V. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice [J]. Neurosci Biobehav Rev，2005, 29: 571-625.

[17] Bazargan M, Hamm-Baugh VP. The relationship between chronic illness and depression in a community of black elderly persons [J]. J Gerontol Soc Sci. 1995. 50B(2): 119-127.

[18] Augustin A, Sahel JA, Bandello F, et al. Anxiety and depression prevalence rates in age-related macular degeneration [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007, 48:1498-1503.

[19] Rachel A. Millstein, Andrew Holmes. Effects of repeated maternal separation on anxiety- and depression-related phenotypes in different mouse strains [J]. Neurosci Biobehav Rev, 2007, 31: 3-17.

Effect of maternal separation stress on behavior of neonatal rd mice

ZHANG Chuan-ling1, DI Tong2, WANG Wen-jing3, NIU Li-li2, XIAO Rui2

(1. School of Pharmacy, Inner Mongolian Medical University, Huhhot 010110，China;2. Key Laboratory of Molecular Pathology, Inner Mongolian Medical University, Huhhot 010059；3. School of Life Sciences and Biopharmaceutics; Shenyang Pharmaceutical University; Shenyang 110016)

Objective To evaluate the effect of maternal separation stress on the behavior of neonatal rd mice. Methods Neonatal rd mice were divided into maternal separation (MS) group (n=9) and control group (n=9). MS-stress was induced in the MS group by 4-hour-separation per day for 28 days. Open field test, elevated plus maze test, forced swim test and tail suspension test were used to evaluate the anxiety-like and depression-like behavior of the neonatal rd mice.Results The stay time and distance travelled of MS group in the central zone were 0.88% and 28.17±5.65 cm, respectively, significantly shorter than that of the control group (2.61%，109.9±9.79 cm.P=0.04,P=0.001). Compared with the control group, the stay time in open arms of the MS group was significantly decreased (P<0.01), while the immobility time in forced swim test and tail suspension test of the MS group were 126.5±10.22 s and 21.56±6.83 s, significantly longer than that of the control group (77.75±16.83 s,P=0.02, 7.37±3.22 s,P=0.03). Conclutions The 28-day maternal separation stress can significantly increase the anxiety-like and depression-like behavior in neonatal rd mice.

rd mice, neonatal; Maternal separation; Stress; Open field test; Elevated plus maze test; Force swim test; Tail suspension test; Anxiety-like behavior; Depression-like behavior

國家自然科學基金(編號31260260),內蒙古醫科大學博士啟動基金(編號：nybq2010zcl)。

張傳領(1978-),男，博士,講師,主要研究方向：民族藥學,神經藥理。

肖瑞(1979-),女，博士,教授,主要研究方向：分子病理,神經退行性疾病，E-mail:xiaorui79@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0089-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.015

2016-11-28