響應(yīng)面法優(yōu)化萵筍廢棄物葉綠素提取工藝試驗(yàn)

付晶晶+唐昭+關(guān)紅艷+程雅芳+孫健

摘要：【目的】萵筍廢棄物中含有豐富的天然葉綠素，利用萵筍廢棄物提取葉綠素，提高萵筍廢棄物利用價值，同時為葉綠素提取原料開拓新的資源。【方法】在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取時間、液固比、提取溫度、轉(zhuǎn)速為自變量，葉綠素得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法，研究各自變量及其交互作用對葉綠素提取量的影響，得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型。【結(jié)果】通過軟件分析，本試驗(yàn)回歸模型預(yù)測萵筍廢棄物葉綠素提取的理論最佳工藝條件為：提取時間56.66min，液固比13.71mL/g，提取溫度43.35℃，轉(zhuǎn)速152.18rpm，在此條件下，葉綠素理論得率可達(dá)0.7706mg/g。驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際葉綠素得率為0.7665mg/g，與理論值相比，其相對誤差為0.53%。【結(jié)論】最佳提取工藝條件為：提取時間57min，液固比14mL/g，提取溫度43℃，轉(zhuǎn)速150rpm。在此條件下葉綠素實(shí)際得率為0.7665mg/g，與預(yù)測值0.7706mg/g相對誤差為0.53%。

關(guān)鍵詞：萵筍廢棄物；葉綠素；提取；響應(yīng)面法

中圖分類號：TS209 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1003-4374（2016）05-0019-06

Abstract：【Objective】The discarded parts of lettuce are rich in natural chlorophyll， and extraction of chlorophyll from lettuce discarded parts can not only beneficial for utilization of waste resources but also play a positive role on environment protection and economic benefit. 【Method】Response surface methodology （RSM） combined with single factor experiments were employed to maximize chlorophyll extraction yield based on Box-Behnken central composite design involving 4 factors （extraction time， liquid/solid ratio， temperature and rotate speed） at 3 levels. The interaction of the respective variables and their influence on the chlorophyll extraction yield were studied， and the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model was set up. 【Result】The results showed that the optimal condition for extraction of chlorophyll was that the extraction time of 57min the liquid/solid ratio of 14mL/g， the extraction temperature of 43℃， and the rotate speed of 150rpm. Under this condition， the measured extraction yield of chlorophyll was 0.7665mg/g， and the relative error was 0.53% compared with the theoretical value of 0.7706mg/g. 【Conclusion】The optimized extraction process parameters can provide a reference for industrial production of chlorophyll from lettuce discarded parts.

Key words： lettuce discarded parts； chlorophyll； extraction； Response Surface Methodology

我國是蔬菜大國，隨著蔬菜產(chǎn)量提高，蔬菜廢棄物的產(chǎn)生也急劇上漲。有研究表明，蔬菜產(chǎn)物：攝取量為1：0.7，即30%的蔬菜成為了廢棄物。據(jù)國家統(tǒng)計局統(tǒng)計，2014年我國蔬菜產(chǎn)量76005.48萬噸，理論上蔬菜廢棄物高達(dá)22802萬噸，直接經(jīng)濟(jì)損失2343億余元。另外，按生活垃圾處理總成本費(fèi)用150元/噸算，我國2014年蔬菜廢棄物垃圾處理費(fèi)理論上近1140億元。因此，對蔬菜廢棄物的回收利用，不論在環(huán)境保護(hù)還是經(jīng)濟(jì)成本核算上都具有重要意義。

萵筍是菊科萵筍屬草本植物，是一種常見的蔬菜，但由于人們的飲食習(xí)慣，僅食用去除葉、皮之外的肉質(zhì)部分，而占萵筍整體40%左右的葉、皮一般會被扔掉。調(diào)查僅廣西南寧淡村農(nóng)貿(mào)市場一個普通攤位每天丟棄掉的萵筍廢棄物就達(dá)30kg左右。這些廢棄物含水量很高，如果按生活垃圾處理成本巨大，同時對環(huán)境造成污染。因此，對萵筍廢棄物的回收利用顯得尤為重要。萵筍葉中富含葉綠素，葉綠素廣泛存在于綠色植物中，是一種天然色素，安全無毒[1]，廣泛應(yīng)用于食品及化妝品領(lǐng)域[2]。葉綠素還具有抗氧化、抗突變、除臭等多種生理功能，在預(yù)防慢性疾病方面發(fā)揮積極作用。近年來，也有研究表明，葉綠素有抑制腫瘤細(xì)胞的作用[3]。目前，對葉綠素提取工藝已有不少報道，如西洋菜[4]，野葛[5]，大麥苗[6]，蠶沙[7]，菠菜[8]等。但經(jīng)檢索還未見對萵筍葉、皮中葉綠素提取開發(fā)的相關(guān)研究。本試驗(yàn)利用萵筍廢棄物提取葉綠素，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝，希望能夠提高萵筍廢棄物利用價值，同時為葉綠素提取原料開拓新的資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萵筍廢棄物：2015年08月于廣西南寧淡村農(nóng)貿(mào)市場取得，新鮮原料經(jīng)勻漿機(jī)粉碎后于-20℃貯藏備用。95%乙醇（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9100紫外可見分光光度計（北京瑞利）；TDL-5-A離心機(jī)（上海安亭）；TS-110X30恒溫水浴搖床（上海科辰）。

1.3 方法

1.3.1 葉綠素測定 試驗(yàn)采用分光光度法測定葉綠素含量，主要是以Arnon計算法為基礎(chǔ)。葉綠素提取量的計算公式如下[9]：

葉綠素含量（mg/g）=式中：A645—樣品稀釋液在波長645nm時的吸收度；A663—樣品稀釋液在波長663nm時的吸收度；n—稀釋倍數(shù)；V—樣品溶液體積，mL；m—樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 萵筍廢棄物中葉綠素提取方法 稱取一定量（按不同液固比加入不同質(zhì)量）樣品，置于100mL具塞三角瓶中，加入40mL95%乙醇，在一定溫度、時間及恒溫培養(yǎng)振蕩器轉(zhuǎn)速下提取。收集提取液，提取液于4500rpm離心5分鐘，稀釋5倍（全部試驗(yàn)過程在弱光下進(jìn)行）。離心后提取液由分光光度計分別于645nm、663nm處測出提取液的吸光度，根據(jù)公式計算出葉綠素的得率。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn) 固定其它因素不變，分別取不同提取時間、液固比、溫度、轉(zhuǎn)速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定其吸光度值，計算葉綠素得率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。利用單因素實(shí)驗(yàn)得到各因素的較優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

（1） 提取時間對葉綠素得率的影響。液固比為 10：1（mL/g）、30℃，靜態(tài)提取，提取時間為20、30、40、50、60、70min。

（2）液固比對葉綠素得率的影響。提取時間為60min、30℃，靜態(tài)提取，液固比分別為5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1（mL/g）。

（3）提取溫度對葉綠素得率的影響。液固比為10：1（mL/g）、提取時間60min，靜態(tài)提取，提取溫度為20、30、40、50、60℃。

（4） 提取轉(zhuǎn)速對葉綠素得率的影響。在液固比為 10：1（mL/g）、提取時間為60min、30℃，轉(zhuǎn)速為0、50、100、150、200rpm。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取每個單因素實(shí)驗(yàn)中較優(yōu)的水平進(jìn)行設(shè)計，對四因素三水平共29個試驗(yàn)點(diǎn)（5個中心點(diǎn)）進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以1，0，-1代表各因素的高、中、低水平。運(yùn)用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。表1為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計表。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取時間對葉綠素得率的影響 由圖1可知，提取時間在20～40min時，葉綠素得率隨著時間的增加上升較快，當(dāng)提取時間大于40min后，葉綠素得率雖有增加，但速度減緩。這可能是由于短時間內(nèi)葉綠素的溶出會隨著時間的增加而增多，但是再增加時間葉綠素的浸出達(dá)到平衡，葉綠素得率也不會有明顯的改變。由于時間過長，成本相對高，因此，選取提取時間為40、50、60min 3個水平，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 液固比對葉綠素得率的影響結(jié)果 通過圖可2以看出，當(dāng)液固比低于10∶1（mL/g）時，葉綠素的得率隨著液固比的增加增大較快，繼續(xù)增加液固比，大于10∶1（mL/g）時，葉綠素得率雖有增加，但增大趨于平緩；這可能是由于液固比較低時，增加液固比可增加傳質(zhì)動力，有助于乙醇對葉綠素提取，但當(dāng)液固比繼續(xù)增大，大部分葉綠素都已溶出時達(dá)到平衡時，葉綠素得率增加緩慢[6]。考慮葉綠素的得率，同時考慮工業(yè)化生產(chǎn)的成本問題，液固比越大成本越高，因此選擇液固比5∶1、10∶1、15∶1（mL/g）3個水平值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 提取溫度對葉綠素得率的影響 由圖3可以看出，提取溫度較低時（20～30℃），隨著提取時間的增加，葉綠素得率增加較快；當(dāng)提取溫度升高（30～50℃），隨著提取溫度的增加葉綠素得率增加逐漸減緩；當(dāng)溫度超過50℃時，葉綠素得率不再上升，甚至出現(xiàn)下降。可能是由于隨著溫度升高，分子運(yùn)動加劇，從而加速乙醇對萵筍廢棄物中葉綠素的溶出，使葉綠素得率增加[10]。但若溫度繼續(xù)上升，由于葉綠素對熱不穩(wěn)定，在高溫下葉綠素易被分解，所以葉綠素得率不會繼續(xù)上升，甚至下降[11]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選取提取溫度為30℃、40℃、50℃，3個水平值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 轉(zhuǎn)速對葉綠素得率的影響 通過圖可4以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速較低（0～150rpm）時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，葉綠素的得率不斷增大；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于150轉(zhuǎn)時，葉綠素的得率幾乎不再增加。因此選擇轉(zhuǎn)速100rpm、150rpm、200rpm3個水平值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得出影響萵筍廢棄物中葉綠素得率的四個影響因素，以提取時間（A）、液固比（B）、提取溫度（C）、轉(zhuǎn)速（D）為響應(yīng)因子，每個因素取三個較優(yōu)水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

利用Design-Expert8.0.5軟件對所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到萵筍廢棄物葉綠素得率（Y）對各因素的回歸模型方程：

Y=0.75++0.014A+0.043B+0.007175C+0.006583D+0.001650AB-0.003175AC+0.000125AD+0.0002500BC-0.006525BD-0.003150CD-0.010A2-0.032B2-0.008467C2-0.017D2

由于該方程為二次方程，二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，即代表的方程圖像的拋物面開口向下，具有極大值，可以進(jìn)行優(yōu)化分析[12]。

2.2.2 回歸方程的方差分析及系數(shù)顯著性分析 表3為回歸方程的方差分析和顯著性檢驗(yàn)，可以看出，F(xiàn)值=22.18，P值<0.0001，說明該模型是有效可靠的，達(dá)到極顯著水平，有意義。失擬項(xiàng)的P值為0.0629>0.05，不顯著，表明對模型有利。模型項(xiàng)A、B、B2、D2都達(dá)到極顯著水平，C、D、A2達(dá)到顯著水平。F值及回歸模型方程的一次項(xiàng)系數(shù)均可判斷影響萵筍廢棄物中葉綠素得率的主次順序：液固比>提取時間>提取溫度>轉(zhuǎn)速[13]。R2=0.9569，說明該模型能解釋95.69%響應(yīng)值的變化，R2Adj=0.9137，說明可信度較高。C.V=1.44，較低，顯示試驗(yàn)穩(wěn)定性較好。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過Design Expert 8.0.5軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，以葉綠素得率為響應(yīng)值的響應(yīng)面圖見圖5～圖10。

由圖5、6、7當(dāng)轉(zhuǎn)速低于150轉(zhuǎn)左右時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，葉綠素的得率不斷增大；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于150轉(zhuǎn)時，葉綠素的得率幾乎不再增加。由圖5、8、10當(dāng)提取時間55分鐘時，葉綠素的得率達(dá)到最高值。由圖6、8、9當(dāng)提取溫度達(dá)43℃左右時，葉綠素的得率達(dá)到最高值。溫度繼續(xù)增高，葉綠素的得率下降。由圖7、9、10隨著液固比的增加，葉綠素的得率不斷增加，但液固比為13以上時，得率增加緩慢，出于成本考慮，不會無限增加液固比。

通過軟件分析得本試驗(yàn)回歸模型預(yù)測萵筍廢棄物葉綠素提取的理論最佳工藝條件為：提取時間56.66min，液固比13.71mL/g，提取溫度43.35℃，轉(zhuǎn)速152.18rpm，在此條件下，葉綠素理論得率可達(dá)0.7706mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，對上述條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。考慮到實(shí)際操作的方便性，將最優(yōu)工藝條件調(diào)整為提取時間57min，液固比 14mL/g，提取溫度43℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通過3組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，求其平均值，得到實(shí)際葉綠素得率為0.7665mg/g，與理論值相比，其相對誤差為0.53%。與預(yù)測值基本相符，說明模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

3 結(jié)論及展望

本試驗(yàn)以萵筍在食用過程中的廢棄物為原料提取葉綠素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面設(shè)計實(shí)驗(yàn)，選取四因素三水平共29個試驗(yàn)點(diǎn)（5個中心點(diǎn)）進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，建立了二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了萵筍廢棄物中葉綠素的提取工藝。確定其最佳提取工藝條件為：提取時間57min，液固比 14mL/g，提取溫度43℃，轉(zhuǎn)速150rpm。在此條件下葉綠素實(shí)際得率為0.7665mg/g（鮮重），與理論值基本相符，說明模型準(zhǔn)確可靠，得到的回歸方程可較好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)中所用原料為新鮮原料，已測萵筍中水分含量為94.6%，估算干重得率為14.19mg /g。葉綠素得率略高于其他已經(jīng)報道的植物中葉綠素含量，如菠菜[14]（0.682mg/g，鮮重），芹菜[1]（9.796mg/g，干重），大麥苗[6]（13.622mg/g，干重），野葛葉[5]（6.91mg/g，干重）。本試驗(yàn)?zāi)軌蛱岣呷n筍廢棄物利用價值，同時由于試驗(yàn)過程中原料萵筍未干燥處理，一定程度是節(jié)約了能源，為進(jìn)一步開發(fā)利用萵筍廢棄物資源提供了科學(xué)的理論依據(jù)，同時為葉綠素提取原料開拓了新的資源。

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