梅花鹿鹿茸Ⅰ型膠原對大鼠成骨樣細胞（ROS1728）的影響及其分子機制的研究

王艷雙+羅速+張大方+曲曉波+李楓

[摘要]該文研究梅花鹿鹿茸Ⅰ型膠原（SPC-Ⅰ）對大鼠成骨樣細胞R0s1728的影響，為SPC-Ⅰ抗骨質(zhì)疏松的治療提供理論依據(jù)。采用貼壁法培養(yǎng)大鼠成骨樣細胞ROS1728，通過CCK-8法檢測SPC-Ⅰ對ROS1728細胞增殖的影響，利用RT-PCR法檢測成骨相關(guān)基因Runx2，osernniX，ALP，CoⅡ-I，OC的表達，利用Western-bolt法檢測Runx2蛋白的表達。結(jié)果表明SPC-I質(zhì)量濃度5g·L^-1組輕度抑制ROS1728細胞的增殖，但能夠明顯促進ROS1728細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2，osterix mRNA的表達，Runx2蛋白的表達，以及標志基因ALP，coⅡ-I，OC mRNA的表達（P<0.01），并且呈現(xiàn)出時間依賴性。SPC-I質(zhì)量濃度2.5，10g·L^-1組均明顯抑制ROS1728細胞的增殖（P<0.01），并抑制相關(guān)基因的表達。該實驗證明質(zhì)量濃度5 g·L^-1組輕度抑制ROS1728細胞的增殖，但可以明顯增強ROS1728細胞的功能，通過調(diào)控Runx2基因的表達，促進ROS1728細胞的分化、成熟。

[關(guān)鍵詞]梅花鹿鹿茸I型膠原（SPC-I）；大鼠骨肉瘤成骨樣細胞系ROS1728；分子機制

正常骨組織代謝是一個動態(tài)的骨重建平衡。成骨細胞在骨重建中起著關(guān)鍵作用，它不但能分泌大量的骨膠原和其他骨基質(zhì)，而且能分泌一些重要的細胞因子和酶類，啟動骨的形成過程，同時也能通過這些因子將破骨細胞偶聯(lián)起來，控制破骨細胞的生成、成熟和分化，抑制骨吸收。骨重建是骨形成和骨吸收有序而精細的偶聯(lián)平衡。當成骨細胞的數(shù)量減少、功能降低時，則骨形成減少，而破骨細胞造成的吸收陷窩不能及時被新骨所填補，成骨細胞與破骨細胞的偶聯(lián)失去平衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。因而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生的關(guān)鍵取決于成骨細胞的數(shù)量和功能狀態(tài)，因此成骨細胞的研究已經(jīng)成為骨代謝研究領(lǐng)域的一個熱點。

鹿茸屬于珍稀名貴的動物性藥材，具有強筋壯骨的確切療效。研究表明鹿茸中含量最多的蛋白質(zhì)是膠原蛋白，膠原蛋白是構(gòu)成骨組織的結(jié)構(gòu)蛋白，可用于骨代謝性疾病及骨質(zhì)疏松癥的治療。梅花鹿鹿茸I型膠原可以通過RANKL/OPG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制破骨細胞的功能，也能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞方向分化。本研究可為SPC-I抗骨質(zhì)疏松的治療提供理論依據(jù)。

1材料

大鼠成骨樣細胞（ROSl728）購自上海復(fù)旦大學(xué)細胞中心。SPC-I（相對分子質(zhì)量3.1X10⁴，質(zhì)量分數(shù)56.89%）購自長春中醫(yī)藥大學(xué)；DMEM-HG培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶，乙二胺四乙酸購自美國Sigma公司；青霉素，鏈霉素粉劑購自華北制藥股份有限公司；RT-PCR試劑盒，引物合成由上海生物工程有限公司提供；Trizol試劑購自Invitrogen公司；氯仿，異丙醇購自北京鼎國生物；CCK-8試劑盒，IP細胞裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，上樣緩沖液（5X），電泳緩沖液，預(yù)染蛋白Marker，Western-blot轉(zhuǎn)膜緩沖液，封閉液，洗滌液，一抗和二抗稀釋液，DAB-HRP顯色試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠Runx2單克隆抗體，羊抗兔IgG/HRP多克隆抗體購自美國BD公司；兔抗大鼠actin多克隆抗體購自武漢博士德。

CO₂細胞培養(yǎng)箱購自日本SHELLAB；生物潔凈安全柜購自蘇凈設(shè)備公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS CK40；全自動酶標儀，全自動凝膠成像儀，PCR儀，濕式轉(zhuǎn)膜槽購自美國BIO-RAD公司；低速離心機購自日本HITDCHI；水平電泳槽，垂直板電泳槽，電泳儀購自北京六一儀器廠；恒溫搖床購自美國Thermo Forma公司；低溫冷凍離心機購自美國Thermo公司。

2方法

2.1ROSl728細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代從 -80℃冰箱中取出凍存細胞，立即將凍存管置入37℃水浴中，使其迅速融化，消毒后移入超凈臺，將細胞懸液置入離心管中，加入DMEM-HG完全培養(yǎng)液5mL，1500r·min^-1離心5 min，棄上清。然后用含20%胎牛血清、100 u·mL^-1青霉素、100 u·mL^-1鏈霉素的DMEM-HG完全培養(yǎng)液5mL稀釋后，接種于25c㎡培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO₂，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長至80%～90%時，倒掉培養(yǎng)液，PBS液洗滌后，加入0.25%胰酶+0.02%EDTA的消化液1.5 mL，使胰蛋白酶流遍細胞表面，倒置顯微鏡下觀察，見細胞質(zhì)回縮，偽足將要消失時，向培養(yǎng)瓶中加入3 mL完全培養(yǎng)液終止消化。用吸管按一定順序吹打貼壁細胞成單細胞懸液，收集于離心管中，1 500 r·min^-1離心5min，棄上清，重新加入DMEM-HG完全培養(yǎng)液，重懸，按1：2接種在新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2SPC-I對ROSl728細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的ROS1728細胞，消化，重懸，計數(shù)。以2.5x10⁴個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，每組3個復(fù)孔。實驗分5組：對照組（空白對照組只加完全培養(yǎng)液，陽性對照組加地塞米松1x10^-8mol·L^-1）；藥物組（I型膠原蛋白2.5，5，10g·L^-1）。24h后更換條件培養(yǎng)液。第1～7天各取出一塊96孔板，每孔加入CCK-820μL，1h后在酶標儀450nm測定吸光度（A），繪制各組細胞的生長曲線，并計算細胞增殖抑制率。細胞抑制率=（1-AA）X100%。

2.3 SPC-I對ROS1728細胞相關(guān)基因的影響

取對數(shù)生長期的ROS1728細胞，消化、重懸、計數(shù)，以2.5x10⁴個/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2mL，每組3個復(fù)孔，實驗分組同上，24h后更換條件培養(yǎng)液。分別在條件培養(yǎng)后48，72h后，RT-PCR檢測Runx2，osterix，ALP，OC，Coll-I，G3PDH基因的表達，基因序列見表1。采用Trizol試劑提取細胞內(nèi)總RNA，檢測其完整性。以總RNA為模板，Oligo為引物，逆轉(zhuǎn)錄酶AMV 42℃進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以所得的cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳結(jié)束后，以全自動數(shù)字凝膠成像儀保存圖像并用Quantiyt One軟件掃描分析，將所擴增特定產(chǎn)物的光密度與管家基因產(chǎn)物的光密度的比值作為評價基因表達水平的指標。登錄GenBank

（http：//www.ncbi.nih.gov/Entrez/ne-cleotide），檢索目的基因的cDNA全長核苷酸序列，用primeir5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計，由上海生工合成。

2.4SPC-I對ROSl728細胞Runx2蛋白表達的影響取對數(shù)生長期的ROSl728細胞，消化、重懸、計數(shù)，以2.5x10⁴個/mL接種于25c㎡培養(yǎng)瓶，每孔5mL，實驗分組同上。24 h后更換條件培養(yǎng)液，分別在條件培養(yǎng)48，72h后，采用Western-blot法測定細胞內(nèi)Runx2蛋白的表達。利用IP細胞裂解液提取細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，BCA法進行蛋白質(zhì)定量，取蛋白質(zhì)40μg與上樣緩沖液混勻，100℃煮沸5min后，進行SDS-PAGE電泳（5%分離膠約1.5h，12%積層膠約4.5h）。結(jié)束后小心剝下凝膠，在轉(zhuǎn)膜液中制作轉(zhuǎn)膜“三明治”，由陰極到陽極依次：一張海綿、三層濾紙、凝膠、硝酸纖維素薄膜、三層濾紙、一張海綿。電壓30V，轉(zhuǎn)膜過夜（16～18h）。蛋白質(zhì)封閉后加入一抗兔抗大鼠Runx2（1：200）、actin（1：200）孵育。然后加入二抗HRP-羊抗兔IgG（1：1000）孵育。加入顯色液即可出現(xiàn)目的蛋白條帶，數(shù)碼相機拍照，利用Image J 2X軟件進行分析，將特定蛋白的光密度與]actin蛋白的光密度的比值作為評價該特定蛋白表達水平的指標。

2.5統(tǒng)計學(xué)分析每個實驗均重復(fù)3次，實驗測得數(shù)據(jù)以x±s表示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01差異性顯著。

3結(jié)果

3.1SPC-I對ROS1728細胞增殖的影響SPC-I對ROS1728細胞的生長增殖均起到抑制作用，作用強度也是有劑量區(qū)別的，見圖1。SPC-I 2.5 g·L^-1組抑制作用較強，與對照組相比差異性顯著（P<0.01）；5 g·L^-1組抑制作用極弱，與對照組相比無差異性；10 g·L^-1組抑制作用較輕，與對照組相比有差異性（P<0.05）；而陽性對照組對ROS1728細胞增殖起到顯著的促進作用，與對照組相比較差異性顯著（P<0.01）。

3.2SPC-I對ROS1728細胞標志基因的影響

大鼠成骨樣細胞ROS1728分化標志基因ALP，Coll-I，OC mRNA的表達均出現(xiàn)與引物相一致的條帶，各實驗組的表達存在差異，但表達結(jié)果也趨于一致，見圖2。SPC-I 2.5，10 g·L^-1組各標志基因的表達量降低，與對照組相比差異性顯著（P<0.01）；5 g·L^-1組各標志基因的表達量增加，與對照組相比差異性顯著（P<0.01）；陽性對照組各標志基因的表達量增加，與對照組相比有差異性（P<0.05）。5 g·L^-1組作用48，72 h呈現(xiàn)出時間依賴性。

3.3 SPC-I對ROSl728細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的影響

大鼠成骨樣細胞ROS1728分化特異性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，osterix mRNA的表達均出現(xiàn)與引物相一致的條帶，各實驗組的表達存在差異，但表達結(jié)果也趨于一致，見圖3。SPC-I 2.5，10 g·L^-1組各標志基因的表達量降低，與對照組相比差異性顯著（P<0.01）；5 g·L^-1組各標志基因的表達量增加，與對照組相比差異性顯著（P<0.01）；陽性對照組各標志基因的表達量增加，與對照組相比有差異性（P<0.05）。5 g·L^-1。濃度組作用48，72h呈現(xiàn)出時間依賴性。

3.4SPC-I對ROSl728細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的影響

Western-blot結(jié)果顯示，大鼠成骨樣細胞ROSl728分化特異性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白的表達，SPC-I2.5，10 g·L^-1組Runx2蛋白的表達量降低，與對照組相比差異性顯著（P<0.01）；5 g·L^-1組Runx2蛋白的表達量增加，與對照組相比差異性顯著（P<0.01）；陽性對照組Runx2蛋白的表達量增加，與對照組相比有差異性（P<0.05）；5 g·L^-1組作用48，72h呈現(xiàn)出時間依賴性，見圖4。

4討論

骨組織是構(gòu)成骨骼的主要成分，主要由骨基質(zhì)和細胞構(gòu)成。其中骨基質(zhì)主要是由成骨細胞合成的細胞外基質(zhì)經(jīng)礦化而成，由有機成分和無機質(zhì)構(gòu)成。無機基質(zhì)由陽離子（鈣、鎂、鈉、鉀、鍶）、陰離子（硫化物、磷、氯化物）和羥基磷灰石等構(gòu)成，提供骨骼硬度和壓力；有機成份以I型膠原為主，還包括骨鈣素、骨橋蛋白、纖維連接蛋白及層連蛋白等無定形基質(zhì)，其中膠原纖維提供骨骼支撐和張力。近年來發(fā)現(xiàn)骨細胞的胞外基質(zhì)在成骨細胞增殖、分化等過程中起著重要的作用。骨的細胞類型主要包括骨原細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞。

本實驗選用大鼠骨肉瘤成骨樣細胞系（ROS1728）作為研究對象。ROS1728是國際上公認并通用的由大鼠來源的成骨樣細胞系，來源可靠，具有正常成骨細胞的許多表型特征和成骨細胞的多種功能，其增殖在某種程度上可反映成骨細胞的增殖，可以用來觀察成骨細胞的增殖和分化，檢測成骨細胞成熟過程中細胞外基質(zhì)的形成及分子生物學(xué)的機制。而且其體外傳代和培養(yǎng)特性可以保持相對穩(wěn)定，各實驗指標重復(fù)性好，經(jīng)常被用來替代成骨細胞進行試驗研究。本實驗觀察到細胞的形態(tài)、生長方式和增殖特性符合成骨樣細胞系的特點，從ROS1728細胞生長曲線可見，SPC-I對成骨細胞生長增殖均起到抑制作用，抑制程度與藥物濃度密切相關(guān)。SPC-I2.5 g·L^-1組抑制程度較強，10g·L^-1組抑制程度較弱，5g·L^-1組抑制作用不明顯與對照組相當，而陽性對照地塞米松則顯著促進增殖。

在成骨細胞分化過程中，多種成骨細胞特異性基因如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、I型膠原蛋白（collagen type I，Coll-I）、骨鈣素（osteocal.cin，OC）等會在不同時期陸續(xù)表達，產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白分泌到細胞外基質(zhì)，從而實現(xiàn)細胞外基質(zhì)的礦化、礦化結(jié)節(jié)的形成，進而完成成骨，形成富含礦物質(zhì)的骨組織。ALP是一種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶。通過水解磷酸單酯將基質(zhì)膠原蛋白分子上的磷酸基團去除，生成磷酸根離子和自由的羥基，增加局部無機磷酸濃度，為骨組織內(nèi)羥基磷灰石結(jié)晶的形成提供條件，同時水解焦磷酸鹽，解除對骨鹽形成的抑制作用、促進礦化，從而啟動細胞外基質(zhì)礦化和鈣磷沉積的過程。因而，ALP是細胞外基質(zhì)成熟的早期標志，在細胞外基質(zhì)合成期開始出現(xiàn)，鈣化期達高峰。ALP隨著細胞分化的進展而表達增強，因此其活性是成骨細胞分化功能的重要指標之一，可以間接反映成骨細胞的功能。Coll-I是骨基質(zhì)中含量最多的蛋白，占骨基質(zhì)有機物的80%～90%，Coll-I是構(gòu)成骨組織的蛋白框架，是鈣鹽沉著以及細胞附著的支架。它的合成分泌是骨組織形成的先決條件，是成骨細胞向基質(zhì)成熟方向分化的標志。加速其合成分泌起到促進骨組織礦化的作用，是成骨細胞分化最早的標志。OC又稱骨y-羧基谷氨酸蛋白或骨依賴維生素K蛋白，是成骨細胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白，該基因只有在礦化期開始后才會被誘導(dǎo)表達。主要表達于成骨細胞，OC對鈣和羥基磷灰石都有很高的親和力，會隨著成骨細胞礦化和分化的進展而增加，當骨鈣結(jié)節(jié)成熟后表達達到高峰。OC作為成骨細胞分化成熟的中晚期標記物之一，是繼ALP表達之后成骨細胞又一個特征性的蛋白質(zhì)，是成骨細胞進入礦化期主要指征之一，可反映成骨細胞的成骨功能。

本實驗結(jié)果顯示，SPC-I對ROS1728細胞分化標志基因ALP，Coll-I，OC的影響也是有濃度區(qū)別的，表達結(jié)果也趨于一致。SPC-I 2.5，10 g·L^-1組各標志基因的表達量降低，可能是抑制2種成骨細胞的增殖，使成骨細胞數(shù)減少，也可能抑制成骨細胞的功能，使標志基因的表達量減少。SPC-I5 g·L^-1組各分化標志基因的表達量增加，雖然它不能使成骨細胞增殖，但可以促進成骨細胞的功能旺盛，使標志基因的表達量增加。研究表明，細胞的分化和增殖是不能共存的，以增殖態(tài)為主的細胞其功能低下，以功能態(tài)為主的細胞其增殖力弱。因增殖旺盛的細胞阻礙分化，若想誘導(dǎo)細胞分化，需要抑制細胞增殖。本實驗SPC-I5 g·L^-1組不促進細胞增殖，而使得細胞的功能增強與之相一致，并且5g·L^-1組作用48，72h呈現(xiàn)出時間依賴性。

成骨細胞標志基因的表達受多種因素的調(diào)節(jié)，其中Runx2，osterix轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響最為顯著。Runx2（runt relatedgene-2，Runt相關(guān)基因-2）又稱Cbfal，屬于Runt/Cbfa轉(zhuǎn)錄因子家族。Runx2是一個多功能轉(zhuǎn)錄因子，相對分子質(zhì)量55kDa，它可以通過調(diào)節(jié)軟骨細胞和成骨細胞的分化以及許多細胞外基質(zhì)蛋白基因的表達，來控制骨的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)Runx2是一種正性調(diào)節(jié)因子，可以驅(qū)動成骨前體細胞轉(zhuǎn)化為成熟的成骨細胞并形成骨基質(zhì)；可以通過與骨基質(zhì)蛋白的啟動子結(jié)合，上調(diào)骨基質(zhì)蛋白的表達，如Coll-I，OC，骨橋蛋白。在成熟的成骨細胞中，Runx2表達雖然低，但對維持成熟成骨細胞的Coll-I和OC的表達不可或缺。osterix是2002年由Nakashima等發(fā)現(xiàn)的只在發(fā)育骨組織中特異性表達的一種轉(zhuǎn)錄因子。它由428個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量46 kD。osterix的C末端存在3個鋅指型DNA結(jié)合區(qū)域，和一個富含脯氨酸和絲氨酸的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域。因此，sterix可作為一種新的具有典型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征的多肽。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏os-terix基因的小鼠缺乏成骨細胞，沒有軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨。同時成骨細胞分化的各種標志物的表達水平也降低，如Coll-I，OC，骨橋素，骨涎蛋白等，提示osterix是成骨細胞分化和骨形成過程中所必需的關(guān)鍵物質(zhì)。osterix位于Runx2的下游參與調(diào)控成骨細胞的生成。

本實驗檢測結(jié)果顯示，SPC-I5g·L^-1組能夠促進ROS1728細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2，osterixmRNA的表達，與標志基因ALP，Coll-I，OC mRNA的表達結(jié)果相一致，并且呈現(xiàn)出時間依賴性。SPC-I5 g·L^-1組能夠促進ROS1728細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白的表達，并且呈現(xiàn)出時間依賴性。

本實驗表明SPC-I5 g·L^-1組首先使在成骨分化的調(diào)節(jié)因子中處于核心地位的Runx2基因表達，Runx2蛋白激活其下游的osterix基因，然后與標志基因上成骨細胞特異性順式作用元件2（OSE2）相結(jié)合，促進成骨細胞標志基因ALP，Coll-I，OC mRNA的表達，從而生成豐富的骨膠原基質(zhì)，通過基質(zhì)礦化而形成新的骨組織。成骨細胞繼而被埋于骨基質(zhì)中成為骨細胞，促進骨細胞的形成。因此SPC-I 5g·L^-1組輕度抑制成骨樣細胞ROSl728的增殖，但可強烈促進ROS1728細胞功能增強，通過調(diào)控Runx2基因的表達，促進ROS1728細胞分化、成熟。本實驗為SPC-I成為抗骨質(zhì)疏松藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

成骨細胞分化過程各種標志物程序性表達，是多種通路調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性使細胞內(nèi)外、核內(nèi)外信號交流的結(jié)果。