基于p38MAPK通路初探大黃黃芩配伍對內(nèi)毒素血證模型大鼠肝臟炎癥的調(diào)節(jié)機制

王沛明+陳文+張袆+王平+孟憲麗

[摘要]為了探究大黃黃芩藥對對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導的內(nèi)毒素血證模型大鼠肝臟炎癥的調(diào)節(jié)機制，選取取雄性SD大鼠50只，隨機分為空白組、模型組、地塞米松組、藥對高劑量組、藥對低劑量組，每組10只。各組大鼠給予相應藥物進行預防性給藥，連續(xù)給藥7d。末次給藥結束0.5h后尾靜脈注射LPs（5 mg·kg^-1）造模，后每0.5h測定一次動物肛溫并記錄，于造模后4h處死動物，測定脾臟胸腺系數(shù)；采用ELISA法檢測肝組織中細胞因子白介素、腫瘤壞死因子-a（TNF-a）的含量；采用比色法測定肝組織中一氧化氮（NO）含量；采用westem blot法檢測肝組織中Toll樣受體蛋白4（Toll樣受體-4），p38MAPK，磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）及一氧化氮合成酶（iN0s）蛋白相對表達量。結果顯示，與空白組大鼠相比，模型組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達、iN0s蛋白表達、p38磷酸化表達升高，IL-1，N0，TNF-a含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，藥對高劑量能顯著降低大鼠肝組織中IL-1，N0，TNF-a的表達（P<0.05或P<0.01），下調(diào)iNOS蛋白表達與p38磷酸化表達（P<0.05），但對TLR4蛋白并未出現(xiàn)顯著的回調(diào)作用；藥對低劑量能顯著降低模型大鼠肝組織中IL-1，N0的表達（P<0.01），顯著下調(diào)iNOS蛋白表達（P<0.01），對p38磷酸化表達具有一定的下調(diào)趨勢但不具有統(tǒng)計學意義，而對TLR4蛋白表達并沒有表現(xiàn)出一定降低作用。大黃黃芩配伍使用可能是通過減少p38蛋白的磷酸化表達從而阻斷p38MAPK信號通路，來減少iN0s蛋白表達和炎性因子IL-1，NO，TNF-a的釋放，從而達到減緩炎癥反應保護機體組織的作用。

內(nèi)毒素血癥是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的脂多糖即內(nèi)毒素進入血液循環(huán)引發(fā)的一系列病理生理改變的總稱，許多嚴重疾病的病理過程中均伴隨著內(nèi)毒素血癥，并成為許多危重癥的重要致死原因。研究表明內(nèi)毒素血癥引起的炎癥反應與組織器官嚴重損傷與多條炎癥通路的激活有關，如核因子（nuclear factor，NF）-KB，Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase signal transduction andtranscription activator，JAK-STAT）信號通路等。其中，p38MAPK信號通路是一條抗炎干預炎癥性損傷的“經(jīng)典”途徑。內(nèi)毒素（LPS）進入血液循環(huán)后，經(jīng)TLR4受體蛋白識別將信號傳人胞漿后激活p38MAPK通路導致p38蛋白磷酸化表達上升，進而導致轉(zhuǎn)錄因子活化，并最終導致iNOS蛋白以及炎癥因子如TNF-a，IL-1，NO等的大量表達，造成機體損傷。而肝臟作為人體中的一個重要的代謝器官，在身體內(nèi)起著去氧化、排毒等作用，在內(nèi)毒素血癥中肝臟通過血液循環(huán)代謝清除癥產(chǎn)物對于炎癥的緩解以及機體的保護起著至關重要的作用。然而肝臟作為代謝的主要場所也常常容易受到炎癥介質(zhì)的侵襲造成肝損傷，而肝臟的損傷又進一步導致機體代謝能力下降，最終導致炎癥損傷進一步加重。

大黃.黃芩作為中藥經(jīng)典藥對，古方多有記載，兩者常常通過配伍使用從而達到增效作用來治療熱毒內(nèi)盛的熱毒證，現(xiàn)有資料已表明大黃、黃芩單味藥對炎癥有良好的緩解和治療作用，然而對于傳統(tǒng)中醫(yī)中二者配伍使用的研究卻鮮有出現(xiàn)。本實驗擬通過建立內(nèi)毒素大鼠模型，選取機體中重要的代謝器官肝臟作為主要研究對象，基于p38MAPK通路初步探究大黃黃芩配伍對炎癥的調(diào)節(jié)機制，并通過對比目前研究現(xiàn)狀揭示其與單味藥使用作用機制與作用強度可能的差別。

1材料

1.1藥物制備

大黃與黃芩藥材購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥學院嚴鑄云教授鑒定分別為藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensjs Georgi.的干燥根。藥對水提物制備：大黃黃芩藥對配伍比例依據(jù)經(jīng)典方劑三黃瀉心湯，大黃黃芩配比為2：1。準確稱取大黃30g、黃芩15g，加水約300mL，浸泡0.5h，用武火煎至沸騰后改用文火煎40min。傾出藥液，加水約240mL再煎25min。合并藥液濃縮至100mL，得0.45（生藥）g·mL^-1，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫趧游锝o藥前以蒸餾水倍比稀釋成1：0.5高、低2個不同劑量，即分別含生藥0.45，0.225 g·mL^-1。陽性藥物：地塞米松片用蒸餾水稀釋成0.75 g·L^-1。

1.2動物

成年雄性SD大鼠，SPF級，體重（200±10）g，由四川成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2013-24。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟腑病癥實驗室動物房，動物使用許可證號SCXK（川）2012-179。

1.3試劑

LPS，Ecdi 055：B5（Sigma公司）；IL-1ELISA試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號141202）；TNF-a ELISA試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號141202）；NO試劑盒（南京建成）；BCA試劑盒（美國賽默飛科技有限公司，批號23227）；兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體，兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體，兔抗大鼠iNOS多克隆抗體（abcam公司）；兔抗大鼠TLR4多克隆抗體（CST公司）；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（SAB公司）；FITC標記的山羊抗兔IgG抗體（北京中衫金橋公司）。

1.4儀器

PowerPAC200電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Trans-Blot轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；Pharos FX熒光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；Varioskan全波長多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific）。

2方法

2.1動物分組及給藥

成年雄性SD大鼠50只，適應性飼養(yǎng)1周后，依照體重與平均體溫將大鼠均衡分為5組，每組10只，分別設為空白組、模型組、地塞米松組、藥對高劑量組（相當于生藥4.5 g·kg^-1）、藥對低劑量組（相當于生藥2.25 g·kg^-1）。各組動物經(jīng)灌胃分別給予相應藥物，每日早晚8：00各給藥1次，給藥體積為5 mg·kg^-1，連續(xù)給藥7d，空白組和模型組給予等體積的純水。

2.2模型制備及樣本采集

實驗前禁食不禁水8h，末次給藥結束后，除空白組外各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射LPS（5mg·kg^-1）造模，空白組使用等體積的生理鹽水進行注射，全部操作均按無菌無熱原要求控制。大鼠注射LPS4h后，使用20%烏拉坦（1.0g·kg^-1）麻醉，剖取大鼠肝臟、胸腺、脾臟，并迅速進行稱重，采集組織迅速置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)至一80℃保存，進而進行后續(xù)相關測試（課題組前期分別選取了2，4，6，8，10 h對內(nèi)毒素血證模型大鼠肝組織炎性因子與TLR4-MAPK信號通路蛋白的變化進行動態(tài)研究，結果發(fā)現(xiàn)相關炎癥指標與蛋白表達在LPS刺激造模后4 h表達升高顯著，因此本次選擇造模4 h后取樣檢測進行研究）。

2.3指標檢測

2.3.1大鼠體溫變化測定

于注射LPS造模結束后0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h分別測定動物肛溫，分析各組動物的體溫變化情況。

2.3.2脾、胸腺組織臟器系數(shù)的測定

稱量并計算各組動物脾臟及胸腺的臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體重（100g）。

2.3.3肝組織IL-1，TNF-a，NO細胞因子的測定

取肝組織用生理鹽水制成10%勻漿，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）按照試劑盒上的要求測定肝組織中IL-1，TNF-a細胞因子的含量；采用比色法按照試劑盒上的要求測定肝組織中NO細胞因子的含量。

2.3.4肝臟TLR4，iNOS蛋白表達含量和p38總蛋白及磷酸化表達的測定

從-80℃冰箱中取出50mg肝組織，用PBS反復沖洗，棄去PBS沖洗液，向肝組織中加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟（phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF）的總蛋白裂液，于冰上進行組織勻漿，將勻漿液放入4℃離心機，15000r·min^-1離心10min，取上清液，少量用于BCA法測定蛋白濃度，其余按1：1與蛋白上樣緩沖液混勻，在沸水中煮10min進行蛋白變性，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)BCA測定總蛋白結果對樣本取樣（按60μg的總蛋白取樣），使用10%聚丙烯進行凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%TBST室溫封閉2 h后，加入1：1 000稀釋的TLR4，p38MAPK，p-p38MAPK，iNOS抗體，4℃搖床過夜，洗膜后加入1：1萬稀釋的二抗，室溫孵育2 h，最終用凝膠成像儀進行檢測。Quantity One軟件對檢測圖像進行分析，分析結束后使用0.1%NaOH漂洗，依照目的蛋白檢測方法對內(nèi)參（GAPDH）進行檢測。以目的蛋白的吸光度（A）與對應GAPDH的A表示該樣品的目的蛋白相對含量。

2.4統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗結果選擇LSD（方差齊）或Tamhane's（方差不齊）。

3結果

3.1造模后大鼠體溫變化

LPS經(jīng)尾靜脈注射人大鼠體內(nèi)后大鼠體溫應激性升高，0.5～1.5h體溫降低，1.5～4h體溫不斷升高，體溫變化與文獻表述保持一致。對比模型組，藥對高、低劑量組能夠一定程度的降低模型大鼠的體溫1.5h后升高的現(xiàn)象，見圖1。

3.2大鼠臟器系數(shù)的變化

對比空白組，模型組與藥對高、低劑量組大鼠脾臟系數(shù)與胸腺系數(shù)均未出現(xiàn)明顯變化，而地塞米松組大鼠脾臟系數(shù)與胸腺系數(shù)均顯著降低（P<0.05），見表1。

3.3肝組織中炎癥因子表達水平比較

對比空白組，模型組大鼠肝組織中IL-1，NO，TNF-a含量顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，藥對高劑量組大鼠肝組織中IL-1，TNF-a，NO顯著降低（P<0.05）；對比模型組，藥對低劑量組大鼠肝組織IL-1，N0顯著降低（P<0.05），TNF-a含量具有一定降低趨勢，但無顯著性差異，見表2。

3.4大鼠肝組織p38MAPK通路相關蛋白表達水平比較

對比空白組，模型組大鼠肝組織p38蛋白磷酸化表達顯著升高，iNOS與TLR4蛋白表達明顯上調(diào)（P<0.05）；對比模型組，藥對高劑量組大鼠肝組織iNOS蛋白的表達與p38蛋白的磷酸顯著降低（P<0.05），但TLR4受體蛋白表達僅表現(xiàn)出了一定的抑制趨勢；對比模型組，藥對低劑量組大鼠肝組織中iNOS蛋白表達明顯降低（P<0.05），p38蛋白磷酸化表達表現(xiàn)出一定降低趨勢，而TLR4受體蛋白的表達未表現(xiàn)降低的趨勢，見圖2～4。

4討論

內(nèi)毒素血癥是由于大量細菌內(nèi)毒素進入血液循環(huán)引起了體內(nèi)一系列免疫反應，進而引發(fā)的一系列病理生理改變，目前對于內(nèi)毒素血癥的研究隨著免疫應答通路研究的進展而不斷的深入，逐漸從簡單的癥狀研究轉(zhuǎn)入對各種細胞通路動態(tài)變化過程的研究，其基本進程大致分成4個部分，即胞膜受體的識別、胞漿信號的傳遞、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子翻譯以及最后炎癥因子的釋放。TLR4蛋白是細胞表面一類重要的受體蛋白，幾乎分布于所有的細胞系中，它可以對不同病原相關分子模式進行識別、結合并引發(fā)下游一系列信號傳導，是病原體的重要傳感器，其參與了細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥及其他多種疾病發(fā)展密切相關。LPS則是TLR4的最重要的配體，LPS與TLR4相結合后通過系列級聯(lián)反應，啟動TLR4介導的信號通路并向下傳導。研究表明黃芩中的有效成分黃芩苷、漢黃芩苷，大黃中的有效成分大黃素等均能降低TLR4蛋白的表達，從而降低炎癥介質(zhì)的釋放。TLR4被激活后通過髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）依賴反應通路，激活人腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factorreceptor-associated factor 6，TRAF-6），并與接頭蛋白TAKl激活蛋白因子（TAKl.binding proteinl TABl）相結合，最終以轉(zhuǎn)化生長因子激活性激酶1tivated kinase 1，TAK-1）為紐帶激活胞漿內(nèi)的p38MAPK通路。現(xiàn)代研究表明p38MAPK通路是MAPK家族控制炎癥反應最重要的成員，能夠促進白細胞的聚集和活化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性和細胞因子的合成，對炎癥反應的調(diào)控起著關鍵性的作用。在受到TLR4通路誘導激活后，通過某種中間環(huán)節(jié)使MAPKKK激活，轉(zhuǎn)而激活MAPKK；MAP.KK激活后再通過雙位點磷酸化調(diào)控p38MAPK的活性導致p38蛋白發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)變?yōu)閜-p38蛋白進而發(fā)生核轉(zhuǎn)位，并調(diào)控下游蛋白激酶，激活炎癥因子例如IL-1，TNF-a等的釋放，從而造成機體組織損傷。因此通過阻斷p38MAPK通路關鍵蛋白的激活與表達，進而阻斷p38MAPK通路信號的傳導，是減少炎癥介質(zhì)釋放，治療內(nèi)毒素血癥的重要途徑之一。

古代并無內(nèi)毒素血癥的病名，但當代研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)熱毒證證型與內(nèi)毒素血癥初期癥狀相似。因此臨床常使用具有瀉火通腑作用的大黃與瀉肺熱解毒的黃芩這2個經(jīng)典中藥藥對來配伍，用于內(nèi)毒素血癥初期的治療。研究表明大黃、黃芩單味藥物對于內(nèi)毒素血癥引起的炎癥均有良好的治療作用，同時數(shù)據(jù)指出當大黃黃芩配伍使用后其抗炎效果往往優(yōu)于單味藥物的使用。基于此課題組進一步深入探討大黃黃芩配伍使用對于內(nèi)毒素血癥引起的肝臟炎癥的調(diào)節(jié)機制。課題組首先通過造模對不同時間點模型大鼠肝組織TLR4，p38MAPK相關信號的動態(tài)變化進行研究，見圖5～6，結果發(fā)現(xiàn)相關指標蛋白表達主要集中在造模4h后顯著升高，因此確定了以4h為時間點作為后續(xù)研究的主要時間點。同時課題組前期對單味藥物進行了相同分子水平的探究，結果顯示，大黃黃芩單味藥物對下游炎癥因子IL-1，TNF-a，NO的釋放均有一定的抑制趨勢，其機制可能與減少調(diào)p38MAPK通路中關鍵蛋白p38蛋白磷酸化減少膜上受體蛋白TLR4表達有關，然而本實驗結果則顯示大黃黃芩配伍后對TLR4受體蛋白表達并未出現(xiàn)顯著的抑制作用，這與單味藥物的作用機制表現(xiàn)出了一定的差別。

綜上所述，借助LPS誘導的大鼠內(nèi)毒素血證模型，并基于p38MAPK蛋白通路，筆者闡明，大黃黃芩配伍使用能夠降低模型大鼠肝組織中炎癥介質(zhì)IL-6，IL-1，TNF-a的釋放，以及iNOS蛋白的表達，并且與p38磷酸化的抑制趨勢相同，但與受體蛋白TLR4的抑制趨勢并沒有顯著的相關性。提示大黃黃芩配伍使用對內(nèi)毒素血證肝臟炎癥的治療機制可能是通過阻斷胞漿內(nèi)的p38MAPK通路來實現(xiàn)的，這與課題組前期單味藥物的研究有所不同，配伍使用并不能對細胞膜上的受體蛋白TLR4蛋白起到一定的抑制作用，原因筆者認為其一可能與劑量有關，中藥水提物中相關成分不能達到單一成分用藥的濃度水平；其二可能與配伍后成分之間的相互反應與相互作用有關，導致相關成分溶出率與化學結構發(fā)生改變有關。然而關于大黃黃芩配伍使用后相對于單味藥使用增效的機制與原因并沒有得出，后續(xù)課題組將繼續(xù)從單味藥物與藥對進行對比研究，觀察相關指標變化，并結合前期課題組對單味藥相關指標的研究，進一步探究大黃黃芩配伍的增效機制。與此同時通過對比主要免疫器官的臟器系數(shù)變化發(fā)現(xiàn)，大黃黃芩藥對比西藥在長期使用后毒性較小，對臟器損傷較輕，體現(xiàn)出中藥在使用中低毒的特性。