毛冬青總黃酮對小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的影響

曹利華+鄭雁+辛衛云+徐坤+苗明三

[摘要]采用小鼠連續注射地塞米松復制血瘀模型，并給予相應藥物，連續灌服15d后，阻斷雙側頸總動脈血流10min，恢復灌注5d后，再次阻斷雙側頸總動脈30min。再灌注24h，復制小鼠腦缺血耐受模型。取血測全血黏度；斷頭取腦，一半腦置于10%福爾馬林溶液中固定，用于HE染色；另一半腦用生理鹽水制備腦勻漿，用于測定腦組織勻漿中ATPase活力、GLU含量、腦勻漿中NOS表達；探討毛冬青總黃酮對小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的保護作用機制。結果顯示，與缺血耐受組（模型組）比較，高劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變高、中、低切值（P<0.01），中、低劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變低切值（P<0.01），明顯減輕小鼠血流變中切值（P<0.05），中劑量毛冬青總黃酮組能夠明顯降低小鼠血流變高切值（P<0.05）；高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著升高各ATPase活力（P<0.01），中劑量毛冬青總黃酮能夠顯著增強Na⁺-K⁺-ATPase活力（P<0.01），低劑量毛冬青總黃酮能夠明顯升高Na⁺-K⁺-ATPase活力（P<0.05）；高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著降低Glu含量（P<0.01），其他給藥劑量能夠明顯降低Glu含量（P<0.05）；高劑量毛冬青總黃酮組可顯著降低小鼠腦組織中TNOS，iNOS的水平（P<0.01），中劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中TNOS，iNOS的水平（P<0.05），低劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中iNOS的水平（P<0.05）；各劑量毛冬青總黃酮均可改善腦組織病理改變。提示毛冬青總黃酮可從降低全血黏度、抑制炎癥介質NOS的表達、降低Glu含量、升高ATPase活力、改善缺血腦部組織病理方面保護小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的腦損傷。

[關鍵詞]毛冬青總黃酮；血瘀合并腦缺血耐受模型；機制

毛冬青為冬青科冬青屬植物Ilex pubescensHook.et Am.的干燥根，生于山坡灌木叢中，是我國南方常用中藥，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效。研究表明，毛冬青可增加冠脈血流量、降低冠脈阻力，可增加腦血流量、降低腦血管阻力，對冠脈血管及腦血管均有一定的擴張作用。毛冬青中含有黃酮類成分、酚性成分、香豆素類、二萜類成分、甾醇、鞣質、糖類及氨基酸多種化學成分，主要成分是毛冬青黃酮苷和總皂苷。本實驗通過復制小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型，觀察毛冬青總黃酮對小鼠腦缺血后全血黏度、腦組織能量代謝，腦勻漿中NOS表達、GLU含量及腦部組織形態學的影響，探討其腦保護作用的特點及可能機制。

1材料

毛冬青總黃酮（質量分數52%，由河南中醫學院分析化學實驗室提供，批號20100627）；華佗再造丸（廣州奇星藥業有限公司，批號7438）；尼莫地平（山東新華制藥股份有限公司，批號0808170）；地塞米松磷酸鈉注射液（DX）（江蘇漣水制藥有限公司，批號0912253）；氯化鈉注射液（鄭州永和制藥有限公司，批號10062121）；水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批號2010302）；甲醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20100601）；ATP（adenosine-triphosphate）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20100719）；Glu（glutamicacid）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20100719）；NOS（nitric oxide synthetase）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20100717）；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20100717）。

LBY-N6A型旋轉式血液黏度計（北京普利生集團）；72-1分光光度計，75-2分光光度計（上海第三分析儀器廠）；玻璃勻漿器（上海玻璃儀器廠）；恒溫水浴鍋（北京市光明儀器廠）；離心機（北京醫療儀器修理廠）；可調式移液器（上海雷勃分析儀器有限公司）。

Wistar小鼠，昆明種，清潔級，雄性，體重25～30g，由河北省實驗動物中心提供，合格證編號1006135。

2方法

2.1造模及給藥取小鼠144只，隨機分為9組，每組16只，分別為毛冬青總黃酮高、中、低劑量組（0.2，0.1，0.05 g·kg^-1；10，5，2.5 g·L^-1），尼莫地平片組（0.02 g·kg^-1，l g·L^-1），華佗再造丸組（1.33 g·kg^-1，66.5 g·L^-1），缺血再灌注損傷組，缺血耐受組（模型組），血瘀假手術組，非血瘀假手術組。從每天后腿肌肉注射地塞米松造血瘀模型開始給藥，每日1次，連續20d，缺血再灌注損傷組、缺血耐受組、血瘀假手術組、非血瘀假手術組給予相同體積的0.1%CMC混懸液。所有小鼠灌胃體積均為0.02 mL·g^-1，其中，所有藥物用0.1%CMC溶液配制。

非血瘀假手術組注射同體積生理鹽水，其余8組，每天給藥1次，同時每天后腿肌肉注射地塞米松0.8 mg·kg^-1（0.01 mL·g^-1），連續給藥15d，禁食12h后，10%水合氯醛麻醉，仰臥固定于手術臺上，頸前正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈。除假手術組和缺血再灌注損傷組外，其余各組均用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈10min作為預處理，然后恢復灌流，假手術組和缺血再灌注損傷組只暴露雙側頸總動脈，不做預處理，所有小鼠繼續灌藥5 d，第5天給藥后1 h，再次經10%水合氯醛0.003 mL·g^-1腹腔麻醉，暴露雙側頸總動脈，除假手術組外其余各組均用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈30min后進行再灌注并縫合，假手術組只暴露頸總動脈，但不阻斷血流。術中維持環境溫度25～26℃。

2.2指標檢測所有小鼠于末次手術24h，統計死亡率后，摘眼球取血1mL，測全血黏度；處死小鼠，迅速剝取腦組織，冠狀切取視交叉后腦組織，10%甲醛溶液固定，用于HE檢測，觀察腦組織形態學變化；準確稱取剩余腦組織質量，按質量體積比加生理鹽水制備成10%的腦組織勻漿，勻漿液經2300r·min^-1，4℃離心10min，取上清液至-70℃冰箱凍存，按照試劑盒操作說明測定腦組織蛋白含量、AT.Pase活力、Glu濃度、NOS活力測定。

2.3數據分析數據分析用SPSS17.0統計軟件，計量資料組間比較采用單因素方差分析；等級資料采用Ridit檢驗。

3結果

3.1對小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型血液流變學的影響與缺血再灌注損傷組相比，缺血耐受組、華佗再造組、中劑量毛冬青總黃酮組死亡率降低；尼莫地平組，高、低劑量毛冬青總黃酮組大鼠死亡率明顯降低；與非血瘀假手術組比較，血瘀假手術組小鼠全血流變高、中、低切值顯著升高（P<0.01），說明該劑量地塞米松可以造成小鼠血瘀模型；與血瘀假手術組比較，缺血再灌注損傷組全血流變值沒有明顯變化，而缺血耐受組（模型組）全血黏度中切、高切值顯著升高（P<0.01），說明手術對其刺激可使血瘀程度進一步加重；與缺血再灌注損傷組比較，缺血耐受組（模型組）全血流變中切、高切值變化明顯（P<0.05）；與缺血耐受組（模型組）比較，華佗再造丸組能夠明顯降低小鼠全血流變中切值（P<0.05），尼莫地平組能顯著降低小鼠全血流變低、中、高切值（P<0.01）；高劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變高、中、低切值（P<0.01），中、低劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變低切值（P<0.01），明顯減輕小鼠血流變中切值（P<0.05），中劑量毛冬青總黃酮組能夠明顯降低小鼠血流變高切值（P<0.05），說明給予毛冬青總黃酮后，血液粘滯程度與給藥劑量大小成反相關。結果見表1。

3.2對小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型腦能量代謝的影響與非血瘀假手術組比，血瘀假手術組ATP酶活力沒有顯著改變，說明造血瘀模型并不能明顯改變腦組織能量代謝；與血瘀假手術組比，缺血再灌注損傷組、缺血耐受組（模型組）ATPase活力顯著降低（P<0.01），說明腦缺血可以降低腦組織的能量代謝；與缺血再灌注損傷組比，缺血耐受組（模型組）ATPase活力升高不明顯，與缺血耐受組（模型組）比，華佗再造丸能夠明顯增強Na⁺.K⁺ATPase，Mg²⁺-.ATPase活力（P<0.05），顯著增強Ca²⁺-ATPase活力（P<0.01）；尼莫地平、高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著升高各ATPase活力（P<0.01），中劑量毛冬青總黃酮能夠顯著增強Na⁺.K⁺.ATPase活力（P<0.01），低劑量毛冬青總黃酮能夠明顯升高Na⁺K⁺-ATPase活力（P<0.05），表明毛冬青總黃酮對小鼠血瘀合并腦缺血耐受動物模型的ATPase活力有改善作用。以高劑量毛冬青總黃酮提高小鼠血瘀合并腦缺血耐受動物模型腦勻漿中ATPase活力為強。結果見表2。

3.3對血瘀合并腦缺血小鼠腦組織Glu含量，NOS活力的影響

與非血瘀假手術組比，血瘀假手術組小鼠腦組織Glu含量、NOS活力沒有顯著變化；與血瘀假手術組比，缺血再灌注損傷組Glu含量、TNOS，iNOS活力顯著升高（P<0.01），缺血耐受組（模型組）Glu含量明顯升高（P<0.05），而TNOS，iNOS活力顯著升高（P<0.01），說明腦缺血使興奮性氨基酸大量釋放、增加自由基的釋放；與缺血再灌注損傷組比，缺血耐受組（模型組）Glu含量、NOS活力明顯降低（P<0.05），說明給予缺血預處理可以降低再次腦缺血造成的興奮性氨基酸的過量釋放、減輕再次缺血所引起的腦組織細胞大量釋放自由基，從而減輕了大量自由基對腦細胞的損傷；與缺血耐受組（模型組）比，華佗再造丸、高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著降低Glu含量、TNOS，iNOS的水平（P<0.01），其他給藥劑量能夠明顯降低Glu含量（P<0.05）；尼莫地平組顯著降低iNOS的水平（P<0.01）、明顯降低TNOS水平（P<0.05），中劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中TNOS，iN.OS的水平（P<0.05），低劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中iNOS的水平（P<0.05）；高、中劑量毛冬青總黃酮對小鼠血瘀合并腦缺血耐受動物模型腦勻漿中NOS表達作用具有優勢；高劑量毛冬青總黃酮能夠減輕再次大缺血造成的腦組織谷氨酸大量釋放，顯著誘導腦缺血耐受產生，作用較優。結果見表3。

3.4對小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型腦組織海馬區組織形態的影響

非血瘀假手術組動物海馬CA1區腦神經細胞基本正常；缺血耐受組（模型組）動物海馬CA1區大部分腦神經細胞基本正常，少數萎縮；血瘀假手術組動物海馬CA1區腦神經細胞基本正常；缺血再灌注損傷組動物海馬CA1區腦神經細胞明顯萎縮；尼莫地平組動物海馬CA1區腦神經細胞基本正常；華佗組動物海馬CA1區腦神經細胞部分萎縮；高劑量毛冬青總黃酮組動物海馬CA1區腦神經細胞基本正常；中劑量毛冬青總黃酮組動物海馬CA1區腦神經細胞部分萎縮；低劑量毛冬青總黃酮組動物海馬CA1區腦神經細胞明顯萎縮。結果見圖1，表4。

經Ridit檢驗，與假手術組相比，缺血耐受組（模型組）、缺血再灌注組有顯著的統計意義（P<0.01），說明造模成功。與缺血耐受組（模型組）相比，高、中劑量毛冬青總黃酮組和陽性對照藥尼莫地平組可顯著減輕腦組織的病理損傷程度（P<0.01），低劑量毛冬青總黃酮組有明顯的統計學意義（P<0.05）；與缺血再灌注組相比，缺血耐受組（模型組），高、中、低劑量毛冬青總黃酮組和陽性對照藥組差異顯著（P<0.01），高、中劑量毛冬青總黃酮對血瘀合并腦缺血小鼠腦組織病理改變較為優越。

4討論

臨床上血栓的形成是導致缺血性腦血管病的一個重要原因，祖國醫學認為活血化瘀是治療腦缺血疾病主要方法和治則。因此，建立與臨床病癥相似的病癥模型，能夠更好地闡明腦缺血耐受的產生及產生機制。根據實驗室前期研究結果，本研究所采用的血瘀合并腦缺血耐受模型是在血瘀的基礎上造成的，缺血程度適宜，手術方法簡單，模型成功率高，動物死亡較少，且與臨床特征較吻合，更適合用于中藥防治缺血性腦血管病的研究。

腦缺血耐受現象（brain ischemic tolerance，BIT）是指預先短暫性缺血或輕度缺氧激發或動員機體內在的防護能力，使機體對隨后嚴重的缺血、缺氧產生防御和保護作用的現象。腦缺血耐受的機制至今還不很明確。研究表明，耐受涉及遞質、受體、通道、基因表達、蛋白質合成的多環節調控的復雜生物學過程。某些中藥提取物能夠提高腦缺血耐受性。毛冬青中含有黃酮類成分、酚性成分、香豆素類、二萜類成分、甾醇、鞣質、糖類及氨基酸多種化學成分，其主要成分是毛冬青黃酮苷和總皂苷。毛冬青總黃酮是從冬青屬植物毛冬青的干燥根中提取出來的一類有效成分，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善血流動力學及抑制平滑肌增生等作用。

腦缺血缺氧后，腦組織內NOS表達上調，產生了大量具有神經毒性的NO、自由基，損傷細胞膜和線粒體呼吸酶，導致神經元死亡及腦組織損傷。NOS也是一重要的炎癥介質，多在免疫應答和神經損傷后才表達。研究表明，給予p38MAPK抑制劑可減少腦組織內NOS表達，從而減少腦梗死體積。目前發現的NOS有3類：神經元型（nNOS）、內皮型（eNOS）和誘導型（inducible NOS，iNOS），其中iNOS在正常組織中未見表達，只有在細胞受到刺激后其表達呈現，可持續產生大量NO。抑制iNOS能夠改善神經功能評分，降低死亡率，減少腦梗死體積比，衰減的形態變化在皮層神經元，降低缺血再灌注損傷的嚴重程度。這些也在一定程度上說明炎癥免疫反應參與了腦梗死所致的腦組織損傷，而NOS是啟動腦梗死后炎癥免疫反應的重要介質。NOS過量表達可造成自由基的大量釋放，產生神經毒性，損傷細胞膜和線粒體呼吸酶，導致神經元死亡及腦組織損傷。缺氧激活KATP通道，可以減輕海馬神經元的去極化，并可對谷氨酸興奮毒性所致的神經元損傷起到保護作用。HE染色是腦組織病理改變最直觀的觀察方法，通過觀察其病理改變，可以直接說明藥物作用的強弱。

本實驗結果表明，小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型復制成功，毛冬青總黃酮能改善地塞米松導致的血瘀程度，使小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的全血黏度降低，使血液流變得以改善；通過抑制炎癥介質NOS的表達，降低再次大缺血時對腦組織的損傷，起到腦缺血耐受作用；減輕自由基對腦細胞的損傷，保護細胞膜和線粒體呼吸酶；并可對谷氨酸興奮毒性所致的神經元損傷起到保護作用，且治療效果顯著。