湖北省黃岡地區嚙齒動物攜帶漢坦病毒M片段基因特征分析

劉冰玉，倪向榮，冉從盾，唐 輝，陳禹銘，劉東瀛，楊占秋

（武漢大學：1基礎醫學院醫學病毒學研究所，病毒學國家重點實驗室，2第一臨床學院，3第二臨床學院，湖北武漢430071）

·預防與轉化醫學·

湖北省黃岡地區嚙齒動物攜帶漢坦病毒M片段基因特征分析

劉冰玉1，倪向榮2，冉從盾3，唐 輝2，陳禹銘2，劉東瀛1，楊占秋1

（武漢大學：1基礎醫學院醫學病毒學研究所，病毒學國家重點實驗室，2第一臨床學院，3第二臨床學院，湖北武漢430071）

目的：探討湖北省黃岡地區野生嚙齒動物自然感染漢坦病毒（hantavirus）情況及病毒基因分型特征.方法：2012～2013年秋冬季在湖北省黃岡地區的野外及居民區采用夾夜法捕鼠.對捕獲的動物進行分類鑒定，取其肺臟提取RNA，合成Seoul病毒（SEOV）和漢灘病毒（HTNV）特異性引物，以RT?PCR方法擴增部分M片段核苷酸序列，對PCR產物進行測序，并進行系統發育和序列同源性分析.結果：共捕獲嚙齒類動物95只，其中褐家鼠75只（78.94%）.6份（8.00%）褐家鼠標本SEOV陽性.系統發育分析關系顯示當地SEOV屬于A組，與Z37株同源性為95.80%～96.30%（核苷酸），97.90%～100%（氨基酸）.黃胸鼠和黑線姬鼠SEOV和HTNV均為陰性.結論：湖北省黃岡地區的優勢鼠種是褐家鼠，漢坦病毒型別主要是SEOV，其系統發育關系屬于A組，且與疫苗株Z37同源性最高.該研究結果有助于為黃岡地區HFRS的預防提供理論依據.

漢坦病毒；嚙齒動物；基因；系統發育分析

0 引言

漢坦病毒（Hantavirus，HV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，為有包膜的負鏈RNA病毒，其基因組由大（L）、中（M）、小（S）三個片段組成，分別編碼RNA聚合酶，包膜表面糖蛋白Gn和Gc，以及核衣殼蛋白.包膜表面糖蛋白Gn和Gc上有多個抗原表位，因此M片段有較大的進化壓力［1］，變異度較大.

HV感染人類后能引起腎綜合征出血熱（hemor?rhagic fever with renal syndrome，HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）.亞洲地區主要以HFRS為主［2］.目前，在全世界范圍內已發現HV有23個種和30個暫定的種［3］.HV的自然宿主是嚙齒動物，食蟲目動物和蝙蝠［4－5］.作為自然宿主，其被感染后無明顯癥狀，病毒在體內繁殖，通過排泄物或氣溶膠把病毒排出體外并被人類接受，導致感染［6］.研究認為，自然宿主長期攜帶病毒而不患病，只不斷向外排毒，是因為病毒長期在中間宿主上生活，為了適應宿主體內環境而相應改變了其遺傳物質，完成病毒與自然宿主的共進化，最終導致了一種HV對應一種或親緣相近的幾種自然宿主.即在HV的進化中，共分化［7］和宿主轉移［7］均起到重要作用［8］.

在我國，HFRS主要由HV中的漢灘病毒（Han?taan virus，HTNV）和漢城病毒（Seoul virus，SEOV）兩型病毒引起，這兩型病毒的主要自然宿主分別是黑線姬鼠和褐家鼠.由于HV與宿主動物間的對應關系，宿主動物的類型及其感染情況決定了疫區流行病毒的型別和流行強度.因此，弄清當地流行的HV基因型別是采取有效防制策略的先決和必要條件.

近年來，每年全球約有30 000人感染HV而致病［9］，中國是受HV危害最嚴重的國家［10］，而湖北省又是HFRS流行區［11－13］，黃岡地區則是其主要疫區之一，但是該疫區內流行的HV的基因型尚不明確.為了研究該地區宿主動物攜帶HV的陽性率和基因分型特點，本研究在2012～2013年捕獲宿主動物，并對其攜帶的HV進行了M片段擴增、測序以及核酸和蛋白序列分析.

1 材料和方法

1.1 標本采集2012～2013年秋冬季在黃岡地區HFRS流行疫點周圍的野外及居民區采用夾夜法，晚放晨取捕鼠.對捕獲的鼠類經分類鑒定和登記后，無菌解剖采集鼠肺標本，放置于液氮中保存待檢.

1.2 引物的設計及合成根據GenBank中HV基因序列，參考Liu等文獻［13］，針對HTNV、SEOV分別設計兩對M片段特異性引物.SEOV引物（nt 53?490）：SEO?M32F／SEO?M343R，SEO?M238F／M511R；HTNV（nt 61?496）引物：HTN?M40F／HTN?M282R和HTN?M255F／M517R（表1）.

表1 漢坦病毒M片段特異性RT?PCR引物

1.3 RNA提取、反轉錄聚合酶鏈反應（RT?PCR）及測序用RNAprep Tissue Kit（Qiagen）從鼠肺中提取RNA.用隨機引物和MMLV反轉錄酶（Promega）合成cDNA.用上述引物擴增部分M片段，并設置陽性對照（SEOV，HTNV病毒標準株），陰性對照（水）.具體擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環，最后于72℃延伸5 min.PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒（Qiagen）進行純化.用ABI 3730自動測序儀測序.

1.4 系統發育分析用BioEdit軟件進行基因序列比對及同源性分析，用MrBayes3.1軟件進行種系發育分析，構建系統發育樹.其他用于比較的HV序列來自于GenBank數據庫.

2 結果

2.1 嚙齒動物采集在黃岡地區居民區及野外共捕獲嚙齒類動物95只，其中褐家鼠75只，黃胸鼠14只，黑線姬鼠6只.褐家鼠占總數的78.94%，為當地的優勢鼠種.

2.2 RT?PCR在75份褐家鼠中，有6份（8.00%）標本SEOV特異性RT?PCR陽性（圖1），并進行PCR產物測序.全部褐家鼠標本HTNV特異性RT?PCR均為陰性.14份黃胸鼠和6份黑線姬鼠標本，SEOV和HTNV特異性RT?PCR均為陰性.

圖1 SEOV陽性樣本M片段PCR擴增結果

2.3 系統發育分析和同源性分析用SEOV部分M片段核苷酸序列構建的系統發育樹見圖2.黃岡地區6份SEOV陽性褐家鼠標本，編號分別為：MQ1?12，MQ1?14，MQ1?15，MQ2，MQ2?17，MQ2?20，在系統發育樹中均屬于SEOV的A組.其中4份標本（MQ1?12，MQ1?14，MQ1?15，MQ2?17）有較高的相似度（核苷酸序列相似度為98.80%～100%，氨基酸序列相似度為98.60%～100%）（表2）.另2份標本（MQ2?2，MQ2?20）與這4份標本的相似度為核苷酸序列相似度為94.50%～95.60%，氨基酸序列相似度為97.20%～100%.黃岡地區SEOV與其他SEOV代表株（80?39，R22，Z37，L99）相比較，相似度為核苷酸序列94.50%～96.30%，氨基酸序列95.80%～100%，與Z37病毒同源性最高（核苷酸序列95.80%～96.30%，氨基酸序列97.90%～100%）.

表2 黃岡地區嚙齒動物攜帶SEOV與其他SEOV代表株的核苷酸、氨基酸序列相似度（%）

圖2 SEOV部分M片段基因系統進化樹

3 討論

湖北省黃岡地區位于湖北省東部、大別山南麓、長江中游北岸.北接河南、東連安徽、南與鄂州、黃石、九江隔江相望.黃岡北部和東部為大別山低山丘陵，海拔多在500～800米；中部為海拔100～250米的丘陵崗地；南部為長江沖積平原，多湖泊.黃岡市自北向南逐漸傾斜、東北部與豫皖交界為大別山脈，主脊呈西北?東南走向.黃岡屬亞熱帶大陸性季風氣候，江淮小氣候區，四季光熱界線分明.其生態環境適于鼠類繁殖，是湖北省HFRS的主要疫區之一.

Zhang等［14］關于湖北省HFRS流行病學的研究表明，黃岡地區的HFRS年發病率，1980～1989年為（5～30）／10 000，1990～1999年和2000～2009年降低為（0～5）／10 000.湖北省HFRS空間?時間分布的分析表明，在2000～2003年黃岡最有可能為HFRS的聚集地.黃岡地區HFRS發病季節，1980～1989年為秋冬季＞70%，1990～1999年和2000～2009年秋冬季發病占30%～70%.HTNV相關的HFRS發病高峰在秋冬季，而SEOV相關的HFRS發病高峰在春季.以上HFRS發病高峰時間的變化提示，在上世紀80年代，黃岡地區HFRS主要是由HTNV引起的，而從上世紀90年代到2009年，SEOV引起的HFRS比例升高.

本研究開展了黃岡地區嚙齒動物攜帶HV的調查，發現當地優勢鼠種為褐家鼠，其次還有黃胸鼠和黑線姬鼠.RT?PCR檢測褐家鼠的HV攜帶率為8.00%，所攜帶病毒均為SEOV.本研究未檢測到黃胸鼠和黑線姬鼠攜帶HV.提示黃岡地區HV的自然宿主以褐家鼠為主，病毒分型以SEOV為主.

Lin等［15］關于SEOV的分析表明，所有國外以及中國的大多數SEOV在系統發育樹中屬于A組，而中國山區的SEOV構成了B，C和D組.A組SEOV起源于中國，然后擴散到歐洲和世界范圍.本研究對黃岡地區嚙齒動物攜帶HV進行了部分M片段基因測序，系統發育分析.發現黃岡地區6只褐家鼠攜帶的SEOV均屬于A組，而并未發現屬于B、C和D組的SEOV.同源性分析提示黃岡地區SEOV與Z37病毒株同源性最高.

SEOV主要由褐家鼠攜帶，能引起輕型HFRS，導致人群隱性感染的幾率高于HTNV.近幾年HV流行病學研究表明我國某些其他地區也是以SEOV為主［16］.這提示隨著我國城鎮化進程的加快，由褐家鼠攜帶的SEOV的流行有逐漸擴大的趨勢.

本研究應用RT?PCR、基因測序和系統發育分析的方法，從分子生物學的角度證實了黃岡地區嚙齒動物攜帶的HV以SEOV為主，從而為本地區HFRS的預防控制提供了科學依據.

［1］Sankar S，Upadhyay M，Ramamurthy M，et al.Novel insights on han?tavirus evolution：the dichotomy in evolutionary pressures acting on different hantavirus segments［J］.PLoS One，2015，10（7）：e0133407.

［2］Jiang H，Du H，Wang LM，et al.Corrigendum：hemorrhagic fever with renal syndrome：pathogenesis and clinical picture［J］.Front Cell Infect Microbiol，2016，6：178.

［3］King AMQ，Lefkowitz EJ，Adams MJ，et al.Virus Taxonomy：classi?fication and nomenclature of viruses.ninth report of the international committee on taxonomy of viruses［M］.San Diego：Elsevier，2012：725－741.

［4］Zhang YZ.Discovery of hantaviruses in bats and insectivores and the evolution of the genus Hantavirus［J］.Virus Res，2014，187：15－21.

［5］Guo WP，Lin XD，Wang W，et al.Phylogeny and origins of hantavir?uses harbored by bats，insectivores，and rodents［J］.PLoS Pathog，2013，9（2）：e1003159.

［6］Kariwa H，Yoshimatsu K，Arikawa J.Hantavirus infection in East Asia［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2007，30（5－6）：341－356.

［7］Plyusnin A，Sironen T.Evolution of hantaviruses：co?speciation with reservoir hosts for more than 100 MYR［J］.Virus Res，2014，187：22－26.

［8］Ramsden C，Holmes EC，Charleston MA.Hantavirus evolution in relation to its rodent and insectivore hosts：no evidence for codiver?gence［J］.Mol Biol Evol，2009，26（1）：143－153.

［9］Watson DC，Sargianou M，Papa A，et al.Epidemiology of Hantavirus infections in humans：a comprehensive，global overview［J］.Crit Rev Microbiol，2014，40（3）：261－272.

［10］Zhang S，Wang S，Yin W，et al.Epidemic characteristics of hemor?rhagic fever with renal syndrome in China，2006－2012［J］.BMC In?fect Dis，2014，14：384.

［11］Zhu N，Luo F，Chen Q，et al.Influence of HLA?DRB alleles on haemorrhagic fever with renal syndrome in a Chinese Han population in Hubei Province，China［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2015，34（1）：187－195.

［12］Li JL，Ling JX，Liu DY，et al.Genetic characterization of a new subtype of Hantaan virus isolated from a hemorrhagic fever with renal syndrome（HFRS）epidemic area in Hubei Province，China［J］.Arch Virol，2012，157（10）：1981－1987.

［13］Liu J，Liu DY，Chen W，et al.Genetic analysis of hantaviruses and their rodent hosts in central?south China［J］.Virus Res，2012，163（2）：439－447.

［14］Zhang YH，Ge L，Liu L，et al.The epidemic characteristics and changing trend of hemorrhagic fever with renal syndrome in Hubei Province，China［J］.PLoS One，2014，9（3）：e92700.

［15］Lin XD，Guo WP，Wang W，et al.Migration of Norway rats resulted in the worldwide distribution of Seoul hantavirus today［J］.J Virol，2012，86（2）：972－981.

［16］Zhang YZ，Zou Y，Fu ZF，et al.Hantavirus infections in humans and animals，China［J］.Emerg Infect Dis，2010，16（8）：1195－1203.

Genetic analysis of M segment in hantavirus?es carried by wild rodents from the Huang?gang area，Hubei province

LIU Bing?Yu1，NI Xiang?Rong2，RAN Cong?Dun3，TANG Hui2，CHEN Yu?Ming2，LIU Dong?Ying1，YANG Zhan?Qiu11Institute of Medical Virology，State Key Laboratory of Virology，School of Basic Medical Sciences，2The First Clinical School，3The Second Clinical School，Wuhan University，Wuhan 430071，China

AIM：To study the infection and genotyping charac?teristics of hantavirus in wild rodents from the Huanggang area in Hubei province，China.METHODS：Rodents were captured in residential area and fields with night trapping method in Huang?gang，Hubei province during autumn and winter from 2012 to 2013.The species of rodents were identified.Then RNA was extracted from lung tissues.Partial M segments of Seoul virus（SEOV）and hantaan virus（HTNV）were detected by using specific RT?PCR.PCR products were sequenced.Phylogenetic relationship and sequence homology were analyzed by using Mr?Bayes 3.1 and BioEdit.RESULTS：A total of 95 rodents were captured，including 75（78.94%）Rattus norvegicus.Six（80%）Rattus norvegicus were identified to be SEOV positive.Phyloge?netic analysis revealed that the SEOV in Huanggang belongs to the phylogroup A.The nucleotide sequence identities between SEOV in Huanggang and stain Z37 were 95.80%to 96.30%，and amino acid sequence identities were 97.90%to 100%.Rattus flavipectus and Apodemus agrarius were both identified to be SEOV negative and HTNV negative.CONCLUSION：The dominant rodent spe?cies was Rattus norvegicus in Huanggang，Hubei province.The predominant hantaviruses carried by these rodents were SEOV，which belonged to phylogroup A，and were closely related with strain Z37.This research is helpful for the prevention of HFRS in Huanggang area，Hubei province，China.

hantavirus；rodent；gene；phylogenetic analysis

R373.9

A

2095?6894（2017）04?48?04

2017－01－12；接受日期：2017－01－28

國家自然科學基金資助項目（81371865，81402728）

劉冰玉.碩士.研究方向：漢坦病毒分子流行病學.

E?mail：563318929＠qq.com

楊占秋.教授.研究方向：漢坦病毒進化與變異.

E?mail：zqyang＠whu.edu.cn