內蒙古地區樣本MRSA和MSSA臨床分離株agr分型特征研究

薛東力，王俊瑞，額爾德木圖，孫 鵬，蘭海霞

（1內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特010110；2內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古呼和浩特010050；3內蒙古醫科大學科技處，內蒙古呼和浩特010110；4內蒙古醫科大學病原生物學實驗室，內蒙古呼和浩特010059；5中國人民解放軍第253醫院，內蒙古呼和浩特010051）

·檢驗與轉化醫學·

內蒙古地區樣本MRSA和MSSA臨床分離株agr分型特征研究

薛東力1，王俊瑞2，額爾德木圖3，孫 鵬4，蘭海霞5

（1內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特010110；2內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古呼和浩特010050；3內蒙古醫科大學科技處，內蒙古呼和浩特010110；4內蒙古醫科大學病原生物學實驗室，內蒙古呼和浩特010059；5中國人民解放軍第253醫院，內蒙古呼和浩特010051）

目的：探究金黃色葡萄球菌附屬基因調節子（agr）在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）臨床株中的分布特征.方法：以50株MSSA株和40株MRSA株作為研究對象，采用多位點序列分型方法（MLST）檢測這些菌株的ST型，進一步采用PCR方法檢測agrⅠ～Ⅳ型基因在2組金黃色葡萄球菌以及不同ST型金黃色葡萄球菌中的分布.結果：MLST結果顯示，MRSA株主要為ST?239型（36株，90.0%），MSSA主要為ST?5型（10株，20.0%），其次為ST?7型（9株，18.0%）.90株金黃色葡萄球菌中agr?Ⅰ基因占86.7%（78株），agr?Ⅱ基因占24.4%（22株），agr?Ⅲ基因占3.3%（3株），agr?Ⅳ基因占3.3%（3株）.MRSA株主要攜帶agr?Ⅰ基因（97.5%／78.0%，P＜0.05），而agr?Ⅱ基因攜帶率明顯低于MSSA，差異具有統計學意義（P＜0.05）.Agr基因調控的毒力基因中，hla和fnbA基因表達率均為100%（90株，90／90），sea基因表達率為47.8%（43株，43／90）.結論：MRSA株和MSSA株agr基因分型特征差異顯著，agr?I型基因在MRSA株中呈優勢表達，其對MRSA株毒力調控基因表達的影響機制值得進一步研究.

金黃色葡萄球菌；agr分型；多位點序列分型

0 引言

金黃色葡萄球菌是引起醫院感染和社區獲得性感染的重要致病菌，可造成皮膚和軟組織的感染，如化膿性骨髓炎等，已成為威脅公眾健康的重大問題之一［1－2］.金黃色葡萄球菌發揮其毒力的途徑主要是通過多種毒力因子來實現的，包括α?溶血素（α?hemoly?sin，hla）、腸毒素A（enterotoxin A，sea）、纖維粘連蛋白A（Fibronectin?binding protein A，fnbA）、殺白細胞毒素D、E（Leucocytic toxin，Luk?D、E）等［3－6］.這些毒力因子表達水平受幾個調控系統的影響，其中之一即為agr調控系統.Agr調控系統全稱為金黃色葡萄球菌附屬基因調節子調控系統（accessory gene regulato?ry system，agr），該調控系統具有雙組份調控特征.Agr系統由2個不同轉錄單位構成，分別由P2和P3啟動子驅動.其中，P2操縱子含有agrB、agrD、agrC和agrA 4個基因.AgrA和agrC形成典型的雙組份信號轉導模型.AgrB、agrD和agrC可形成至少4種agr類型組，即agr?Ⅰ、agr?Ⅱ、agr?Ⅲ和agr?Ⅳ4種.Agr基因的分化特征被認為與金黃色葡萄球菌的系統發育有關，并與菌株特定毒力特征有關，如agr?Ⅲ基因陽性菌株常可引起毒性休克綜合征.另有研究［7］顯示，不同來源菌株agrⅠ～Ⅳ型基因分布具有十分明顯的特征.多重耐藥金黃色葡萄球菌（multi?resistant Staphylococcus aureus，MRSA）等［8－9］在住院患者中分離率的不斷提高，進一步闡明MRSA致病特征及其遺傳背景特征對于更好地防控和治療MRSA感染及研發新型抗MRSA感染藥物具有重要意義.

本研究旨在對MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）臨床分離株中agrⅠ～Ⅳ等位基因分布特征進行初步研究，探究MRSA臨床分離株中優勢agr等位基因及其調控的下游關鍵毒力基因的表達特征，為更好地闡明agr調控系統在MRSA致病中的作用機制提供更多實驗數據和思路.

1 材料和方法

1.1 菌株的收集收集2011－12／2013－10內蒙古地區不同醫院住院患者分離90株金黃色葡萄球菌作為研究對象，其中MRSA40株、MSSA50株.33株分離自傷口分泌物，其中19株為MRSA，14株為MSSA；15株分離自膿液，其中4株為MRSA，11株為MSSA；13株分離自全血標本，其中6株為MRSA，7株為MSSA；18株分離自下呼吸道，其中9株為MRSA，9株為MSSA；6株分離自咽拭子，其中1株為MRSA，5株為MSSA；2株分離自尿液標本，全部為MSSA；1株分離自腹水，且為MSSA；1株分離自關節腔積液，為MRSA菌株；1株分離自糞便標本，為MSSA菌株.所選菌株再次采用革蘭陽性球菌鑒定卡（GP卡）（法國生物梅里埃公司）進行鑒定和確認.采用頭孢西丁紙片擴散法核對甲氧西林敏感株，質控菌株（ATCC 25923）由本實驗室保存，藥敏結果判斷依據為美國臨床與實驗室標準化協會標準（CLSI 2015版）［10］.

1.2 多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST） 按照試劑盒（細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司）說明書對各菌株純培養物進行DNA提取，利用金黃色葡萄球菌MLST分型［11］用7個管家基因（arc，aro，glp，gmk，pta，tpi，and yqi）特異性引物進行PCR擴增.具體實驗步驟參考王俊瑞等的方法［11］進行.最終純化PCR產物并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果與MLST數據庫（http：／／saureus.mlst.net）中序列進行比對，得到每株菌ST分型.

1.3 agr等位基因檢測按照1.2中提取各菌株DNA進行多重PCR反應［12－13］，擴增agr4個等位基因（agr?Ⅰ，agr?Ⅱ，agr?Ⅲ和agr?Ⅳ）以及agr調控系統關鍵下游調控毒力基因（hla，fnbA和sea）進行擴增.引物序列信息見表1［14－16］.

表1 agr（agr?Ⅰ，agr?Ⅱ，agr?Ⅲ和agr?Ⅳ）、毒力基因擴增引物

1.4 統計學處理采用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料采用MRSA與MSSA株中各基因分布差異行χ2檢驗.P＜0.05表示差異有統計學意義.

2 結果

2.1 MLST分型MRSA主要是ST?239（90.0%，36／40），其次為ST?338（5.0%，3／40）；50株MSSA中最常見的類型為ST?5（20.0%，10／50），其次為ST?7（18.0%，9／50，表2）.7個管家基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示.

表2 MRSA株和MSSA株MLST分型結果

圖1 部分菌株MLST分型7個管家基因瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 不同標本分離菌株MLST分型結果90株金黃色葡萄球菌中，ST?239主要標本類型為傷口分泌物（48.7%，18／37），ST?5主要標本類型為膿液（40.0%，4／10），見表3.

表3 不同類型標本分離菌株MLST分型結果

2.3 agr等位基因分布特征所有90株菌種agr基因陽性率（100%，90／90）.agr?Ⅳ基因僅存在于MSSA菌株中，而MSSA菌株agr?Ⅱ攜帶率明顯高于MRSA菌株，差異具有統計學意義（38.0%／7.5%，P＜0.05）.此外，MRSA株agr?Ⅰ基因攜帶率明顯高于MSSA菌株，差異具有統計學意義（97.5%／78.0%，P＜0.05，表4）.Agr各型別PCR擴增產物見圖2～5.

表4 agr調控基因在不同菌株中的分布n（%）

圖2 部分菌株agr?Ⅰ基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

圖3 部分菌株agr?II基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

圖4 部分菌株agr?III基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

圖5 部分菌株agr?IV基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

Agr各亞型基因分布在不同ST型金黃色葡萄球菌中的分布特征：ST?239型中37株為agr?Ⅰ基因；ST?5型中8株為agr?Ⅱ基因，6株為agr?Ⅰ基因；ST?7型全部為agr?Ⅰ基因；ST?15型中8株為agr?Ⅱ基因，2株為agr?Ⅰ基因，見表5.

表5 agr調控基因在不同ST型菌株中的分布

2.4 毒力基因分布特征Agr基因調控的毒力基因中（PCR擴增結果見圖6～8），hla、fnbA在90株金黃色葡萄球菌中的總陽性率為100%（90株，90／90），sea陽性率為47.8%（43株，43／90），且MRSA菌株的攜帶率明顯高于MSSA菌株（77.5%／24.0%），差異有統計學意義（P＜0.05，表6）.

圖6 hla毒力基因部分分布

圖7 fnbA毒力基因部分分布

圖8 sea毒力基因部分分布

表6 各毒力基因在MRSA、MSSA菌株中的分布n（%）

3 討論

本研究以內蒙古地區住院病人分離90株MRSA和MSSA株為研究對象，首先對2類菌株MLST分子分型特征及agr等位基因分布特征進行了研究.納入研究的菌株中，agr?Ⅰ型基因分布率最高，其次為agr?Ⅱ型基因，agr?Ⅲ和agr?Ⅳ基因總陽性率僅為3.3%.而Khan等［17］和Xie等［18］研究均發現金黃色葡萄球菌臨床分離株中agr?Ⅰ和agr?Ⅲ基因陽性率最高，與本研究結果存在一定差異，這提示，不同地域分離株可能由于基因背景差異導致agr基因型進化上出現差異.Agr?Ⅱ型基因在國內不同地區分布特征差異及其機制有待進一步研究.國外一些研究顯示，MRSA株中agr?Ⅱ型基因陽性率明顯高于其它三個agr亞型基因［19－21］，而且這類菌株在萬古霉素作用下，agr?II基因的表達水平明顯增高，提示萬古霉素可能參與agr?Ⅱ陽性MRSA株的毒力調控.更有研究［19］顯示，MRSA株agr?Ⅱ陽性可能預示其對萬古霉素治療的耐受.進一步分析本研究結果發現，40株MRSA株中agr?Ⅱ基因陽性率（7.5%）明顯低于MSSA株（38.0%）.相反，40株MRSA株agr?Ⅰ基因陽性率（97.5%）高于MSSA株（78.0%）.不同地區分離株agr基因多態性及其毒力調控特征值得進一步探究.

另外，對90株金黃色葡萄球菌進行MLST分型發現，MRSA株主要為ST?239型（90.0%），MSSA株主要為ST?5型（20.0%），其次為ST?7型（18.0%）.ST?5型菌株主要攜帶agr?Ⅱ基因（40.0%），攜帶率明顯高于agr?Ⅰ基因（7.9%）.提示agr基因型與菌株ST可能存在一定相關性，但由于本研究所選菌株數量有限，其相關性尚需進一步研究確定.

agr基因與毒力基因之間有一定的相關性［22］，我們進一步對agr調控系統調控的幾個關鍵毒力基因（hla、fnbA和sea）在90株金黃色葡萄球菌中的分布特征進行了研究.結果發現，hla和fnbA基因陽性率均為100%，與國內一些最新研究結果相似［23－26］，但明顯高于國內另外相關研究所得數據［27］.溶血素基因在MRSA中高度保守，其蛋白能破壞多種宿主細胞，還有多種促炎效應，是導致金黃色葡萄球菌肺炎和膿毒癥的重要毒素因子［28］.本研究中另一個檢測的毒力基因fnbA陽性率也為100%，與國內一些相關研究結果相同［23，29］，同樣高于國內另外一些研究所得結果［26，30］.fnbA蛋白主要負責金黃色葡萄球菌與宿主細胞和細胞外基質進行粘附和生物被膜的形成.hla和fnbA表達率高，提示這些菌株可能具有更強的體外粘附和侵襲能力.另外，我們檢測的sea基因陽性率為47.8%（43株，43／90），而且MRSA菌株的攜帶率明顯高于MSSA菌株（77.5%／24.0%），這一結果與申麗等［25］的研究結果相近.但該比例明顯高于另外一些研究結果［27］.Sea與MRSA株致病性的相關性及與地區分布特征之間的相關性值得進一步研究.金黃色葡萄球菌毒力基因分布特征與特定克隆株的致病性密切關聯，不同地區優勢克隆株毒力基因及其調控系統的分布需要更深入的研究，高表達的毒力蛋白可能作為今后金黃色葡萄球菌靶向抗菌藥物研發的靶點，特別是對于MRSA及萬古霉素異質性耐藥金黃色葡萄球菌等多重耐藥菌株的重癥感染.

另外，本研究未發現agr陰性菌株，這一現象值得我們進一步研究.Paulander等［31］的研究指出15%～60%的金黃色葡萄球菌臨床分離菌株是agr缺陷性菌株，他們認為抗生素的過量使用是造成金黃色葡萄球菌大量菌株出現agr陰性的原因，agr的缺失與抗生素的使用和菌株的變異之間存在著直接的聯系，并且認為agr陰性的菌株比agr陽性的菌株對某些抗生素的亞致死濃度具有更好的適應性.

本研究中檢測的MRSA菌株，其agr?Ⅱ基因攜帶率顯著低于國外相關研究報道.萬古霉素治療對該型菌株耐藥性演變及在人群中的傳播如何產生影響值得我們進一步關注和探究.

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Study on the Agr genotyping features of MRSA and MSSA clinical isolates from Inner Mongolia

XUE Dong?Li1，WANG Jun?Rui2，Erdemtuu3，SUN Peng4，LAN Hai?Xia5

1Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China；2Clinical Laboratory，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medi?cal Univercity，Hohhot 010050，China；3Department of Science and Technology，Inner Mongolia Medical Univercity，Hohhot 010110，China；4Pathogenic Organisms Laboratory，Inner Mon?golia Medical Univercity，Hohhot 010059，China；5The 253rd Hospital of People's Liberation Army，Hohhot 010051，China

AIM：To investigate the distribution characteristics of accessory gene regulator（agr）in clinical strains of methicillin?resistant staphylococcus aureus（MRSA）and methicillin sensitive staphylococcus aureus（MSSA）.METHODS：A total of 50 strains of MRSA and 40 strains of MSSA were selected as the research objects.The multilocus sequence typing（MLST）was used to detect the ST types，then polymerase chain reaction（PCR）was used to detect the distribution of agrⅠ～Ⅳgenes in these 2 groups of staphylococcus strains and staphylococcus aureus with different ST types.RESULTS：The MLST showed that MR?SA strains were mainly clustered into ST?239 type（36 strains，90%），and MSSA strains mainly belonged to ST?5（10 strains，20%），followed by ST?7（9 strains，18%）.Among the 90 strains of staphylococcus aureus tested，the positive rate agr?Ⅰgenes was 86.7%（78 strains），and positive rates of the other three agr genes were respectively 24.4%（22 strains），3.3%（3 strains）and 3.3%（3 strains）.MRSA strains carried higher rate of agr?Ⅰgene（97.5%／78%，P＜0.05），while the carrying rate of agr?Ⅱgene in the MRSA strains was significantly lower than that of the MSSA（P＜0.05）.As one of the virulence genes regulated by agr regulatary system，expression rate of both hla and fnbA were 100%（90 strains，90／90），while the carrying rate of sea gene was 47.8%（43 strains，43／90）.CONCLUSION：Agr genoty?ping features of MRSA and MSSA strains tested in this study are significantly different.Agr?Ⅰgene is predominatly expressed in MRSA strains，and the regulatory mechanism of this regulating system in MRSA strains is still needed to be further investigated.

staphylococcus aureus；Agr genotyping；multilocus sequence typing

R446.5

A

2095?6894（2017）04?55?06

2016－11－26；接受日期：2016－12－12

內蒙古科技計劃項目（20140144）；內蒙古自然科學基金項目（2016MS0829）；內蒙古自治區衛生和計劃生育委員會科研項目（201303061）

薛東力.碩士在讀.E?mail：347342672＠qq.com

蘭海霞.副主任醫師.E?mail：08shuoshuo＠163.com