兒茶酚胺在束縛應激大鼠肺損傷中的作用

李 莉，張曉靜，劉 威，宋 寧，喻昌利*

(1.華北理工大學附屬醫院呼吸內科，河北 唐山 063000；2.河北醫科大學法醫系，河北省法醫學重點實驗室，河北 石家莊 050017；3.河北省胸科醫院骨科，河北 石家莊 050042；4.河北醫科大學第二醫院感染科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

兒茶酚胺在束縛應激大鼠肺損傷中的作用

李 莉1，張曉靜2，劉 威3，宋 寧4，喻昌利1*

(1.華北理工大學附屬醫院呼吸內科，河北 唐山 063000；2.河北醫科大學法醫系，河北省法醫學重點實驗室，河北 石家莊 050017；3.河北省胸科醫院骨科，河北 石家莊 050042；4.河北醫科大學第二醫院感染科，河北 石家莊 050000)

目的研究兒茶酚胺(catecholamine，CA)在束縛應激大鼠肺損傷中的作用。方法選取成年SD雄性大鼠15只，隨機分為對照組、束縛應激組、束縛+酪氨酸羥化酶抑制劑(alpha-methyl-p-tyrosine，AMPT)組，每組5只。采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿中去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)水平，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察肺組織病理形態學變化，ELISA法檢測肺組織中白細胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)及白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)的濃度，二辛可酸法檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中蛋白的含量。結果束縛應激組、束縛+AMPT組血漿中NE、E水平顯著高于對照組，束縛+AMPT組血漿中NE、E水平顯著低于束縛應激組(P<0.05)；束縛應激組、束縛+AMPT組肺組織中IL-1β、IL-6濃度和BALF中蛋白含量均顯著高于對照組，束縛+AMPT組肺組織IL-1β、IL-6濃度和BALF中蛋白含量顯著低于束縛應激組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論束縛應激可致肺損傷，CA可能參與這一損傷過程，AMPT可明顯減輕肺損傷。

肺損傷；兒茶酚胺；束縛應激

應激是指機體受到各種內外環境因素及社會、心理因素刺激時所出現的全身性非特異性適應反應，也稱應激反應[1]。根據其來源不同，應激原大致分為三類：外環境因素、內環境因素和心理社會因素[2]。現代社會生活步伐加快，人們總是面臨著生活、工作和情感壓力的超負荷，這些超負荷可以作為心理社會因素使機體處于應激狀態。適度應激一方面可以調動機體的非特異性免疫系統，增強對疾病的抵抗力，具有重要的防御代償意義；另一方面，過度持久的應激會打破內部環境的穩定狀態，引起多種應激相關性疾病。應激對健康的影響以及應激相關性疾病的防治已經成為亟待解決的醫學問題。應激時，激活多種神經和內分泌反應，其中起主要作用的是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸和交感神經系統(sympathetic nervous system，SNS)[1]，交感神經系統激活后釋放兒茶酚胺(catecholamine，CA)。CA是一組含有兒茶酚或3,4-二羥基苯基和胺基的物質，由去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)共同組成，是重要的應激激素。束縛應激模型是公認的復制心理社會應激的動物模型[3]。有研究表明束縛應激對大鼠孤束核[4]、腸道[5]的損傷作用均與CA有關。離體實驗的研究表明應激激素CA可以激活巨噬細胞產生炎癥因子[6]。肺臟富含巨噬細胞，那么應激時肺臟是否會發生炎癥反應，目前尚不明確。因此，本研究擬建立束縛應激的動物模型，旨在探討束縛應激對肺臟炎癥反應的影響以及CA在其中的作用。報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源 清潔級SD雄性大鼠15只，體質量230～250 g，購自河北省實驗動物中心，恒溫(23±2) ℃，濕度45%～65%，每日光照12 h。合格證：1604027。采用隨機數字表法將15只大鼠隨機分為對照組、束縛應激組、束縛+酪氨酸羥化酶抑制劑(alpha-methyl-p-tyrosine，AMPT)組，每組5只。所有實驗過程嚴格遵循科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 實驗方法 ①對照組：每日相應時間禁食水，其余時間自由活動。②束縛應激組：將大鼠按照固定時間放入束縛模具內(束縛模具由透明材質制成，長約20 cm，直徑約5 cm，前后兩端及側壁均有對稱的透氣孔)，束縛時間為第1天、第2天晚22:00至次日早06:00(8 h)，第3天、第4天晚22:00至次日早08:00(10 h)，第5天至第7天晚20:00至次日早10:00(12 h)，7 d為1個周期，連續束縛14 d。③束縛+AMPT組：大鼠在每日束縛應激前2 h腹腔注射AMPT(100 mg/kg)，其余時間自由活動，共14 d。

1.3 體質量測定 每天實驗后于固定時間測量并記錄對照組與束縛應激組大鼠體質量，以評價束縛應激模型是否成功建立。

1.4 CA濃度檢測 于造模結束后用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mL/100 g)后，打開腹腔，將腹腔臟器向一側翻轉，剝離腹主動脈筋膜組織，用一次性采血針做腹主動脈穿刺可見回血后，另一端插入真空管中抽取血液，離心機離心(13 000 r/min，15 min)取上清，-80 ℃冰箱保存待用。應用CatCombi ELISA 試劑盒檢測NE、E水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5 肺組織病理形態學觀察 腹主動脈放血處死后，取左肺葉，冰生理鹽水快速沖洗干凈，10%中性福爾馬林固定48 h，常規石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察肺形態學變化。

1.6 肺組織IL-1β、IL-6檢測 腹主動脈放血處死后，取右肺葉，冰生理鹽水中快速沖洗干凈后立即放入液氮，-80 ℃保存待用。每100 mg組織中加入500 μL裂解液制備勻漿后10 000 r/min，5 min，4 ℃離心取上清，采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法測定組織中的白細胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)及白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.7 BALF蛋白含量檢測 腹主動脈采血處死后，剪開頸、胸部皮膚，暴漏氣管并行氣管插管。用20 mL冰生理鹽水分2次進行整肺灌洗(灌洗時保證每次打入、吸出等體積的液體)，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)置冰上，離心(4 ℃，1 500 r/min，10 min)，收集上清液，-80 ℃保存待用。用二辛可酸法測定BALF中蛋白的含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.8 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計量資料比較分別采用t檢驗、單因素方差分析和q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 體質量變化 造模14 d后，束縛應激組體質量明顯低于對照組[(253.17±2.35) gvs(275.11±4.40) g]，差異有統計學意義(t=7.611，P<0.05)。提示成功復制大鼠束縛應激模型。

2.2 大鼠血漿中NE、E水平變化 束縛應激組、束縛+AMPT組血漿中NE、E水平顯著高于對照組，束縛+AMPT組血漿中NE、E水平顯著低于束縛應激組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血漿中NE、E水平比較Table 1 Comparison of NE and E levels in plasma of rats in each group

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與束縛應激組比較(q檢驗)

2.3 肺組織病理形態學變化 對照組肺泡充氣良好，肺泡及間質無炎性細胞浸潤、無水腫、無血液滲出，肺泡隔無增厚，肺毛細血管輕度淤血；束縛應激組肺泡隔增厚，肺泡腔及間質內炎性細胞浸潤，部分肺泡塌陷、不張，肺毛細血管中度淤血；與束縛應激組相比，束縛+AMPT組肺組織病理學變化有所減輕，肺泡充氣較好，間質及肺泡內炎性細胞及血液滲出減少，間質水腫減輕，肺毛細血管淤血減輕(圖1)。

圖1 大鼠HE染色結果(光鏡 ×200)
A.對照組;B.束縛應激組;C.束縛+AMPT組
Figure 1 Results of HE staining in rats(light microscope ×200)

2.4 肺組織中IL-1β、IL-6濃度及BALF中蛋白含量變化 束縛應激組、束縛+AMPT組肺組織中IL-1β、IL-6濃度和BALF中蛋白含量均顯著高于對照組，束縛+AMPT組肺組織IL-1β、IL-6濃度和BALF中蛋白含量顯著低于束縛應激組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組肺組織中IL-1β、IL-6濃度及BALF中蛋白含量比較Table 2 The protein content of BALF, IL-6 and IL-1β in lung tissue of each group

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與束縛應激組比較(q檢驗)

3 討 論

雖然現在關于應激的研究越來越多，但國內外學者對于應激相關性疾病的研究主要集中在心血管系統[7]、消化系統[8]、免疫系統[9]及精神神經系統[10]等，關于應激對肺臟的影響少有文獻報道。肺臟是全身靜脈血液的過濾器官，其受損后易發生急性呼吸窘迫綜合征，嚴重時甚至會出現呼吸衰竭，影響循環系統和中樞神經系統的功能，加速多器官功能衰竭綜合征的發生[11]。因此，研究應激對肺臟的影響有重要的意義。

隨著應激研究的不斷深入，動物模型的構建成為研究成功的關鍵。而束縛應激模型是公認的復制心理應激的經典動物模型[3]。有實驗表明，束縛大鼠時間不同，可引起大鼠不同程度的應激反應[12]。鑒于重復束縛應激與單次束縛應激對機體的影響不同，研究者可以根據具體的研究目的選擇具體的束縛方式。相對急性束縛應激，慢性束縛應激更符合人身心疾病的發生發展過程，更具有實際意義，本研究采用慢性束縛應激模型。機體對應激原刺激有一定適應性，只有不斷改變應激方式或強度才能最大程度減弱適應反應[13]。因此，本實驗采用逐漸增加每日束縛時間增加應激強度，減弱動物的適應性。

束縛應激模型建立后，監測體質量變化是一種簡便、有效評價束縛應激模型的方法[14]。本研究結果顯示，束縛14 d時，束縛應激組大鼠體質量明顯低于對照組，證明成功建立了束縛應激模型。應激使大鼠束縛后體質量增長減緩的原因可能有以下幾點：①束縛應激時動物處于超熱狀態，能量物質消耗增加；②應激狀態下動物進食量減少；③應激時糖皮質激素和CA水平升高，使機體的血糖和游離脂肪酸含量均升高，導致機體分解代謝增加，體質量增長減緩[15]。

應激過程中神經內分泌反應主要包括HPA軸和SNS[1]。有研究表明，長期應激時糖皮質激素的作用逐漸衰減，SNS的作用逐漸凸顯出來[16]。SNS激活后釋放CA，CA一方面可激活免疫細胞，增強局部炎癥反應，使促炎因子產生增加[17]；另一方面，可以通過抑制T細胞功能抑制免疫反應。提示CA在神經免疫調節中具有重要作用。肺臟富含多種免疫細胞，可以分泌多種炎癥因子，免疫細胞的激活參與多種肺臟疾病的發生發展 。因此，研究CA對肺臟炎癥反應的影響，對于闡明肺癌[18]、哮喘[19]等與應激有關疾病的發病機制具有重要意義。

本研究檢測了大鼠外周血CA水平，束縛應激組血漿中NE、E水平顯著高于對照組。提示束縛應激使大鼠產生了一定強度的應激反應。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是CA合成的限速酶[20]。酪氨酸經TH轉化成左旋多巴，然后左旋多巴脫羧生成多巴胺，多巴胺再通過多巴胺β-羥化酶最終轉化為NE，最后NE通過苯乙醇胺N-甲基轉移酶轉化為E。所以，TH在生物體內活性和表達的變化直接影響CA的生物合成[21]。本研究顯示應用AMPT可以明顯降低NE、E水平。本研究進一步觀察了肺組織病理學變化，束縛應激組肺組織出現比較明顯的炎癥改變；此外，束縛應激組肺組織中IL-1β、IL-6水平及BALF中蛋白含量均高于對照組。提示束縛應激可以引起肺損傷，而給予AMPT可以明顯減輕束縛應激引起的肺臟炎癥改變，表明束縛應激所致肺損傷可能與CA升高有關，抑制TH可明顯減輕肺損傷。有研究表明，CA可以作用于巨噬細胞，巨噬細胞被激活后可釋放活性氧和其他炎癥因子[22]。細胞研究證實，阻斷巨噬細胞來源的CA可以大大減輕肺炎癥反應[23-24]。給臨床工作提供了新的啟示，即在臨床對患有感染性疾病的患者治療時，降低心理應激的負面影響可能有助于降低休克發病率和病死率，從而有利于疾病的治療。

綜上所述，本研究證實束縛應激可致肺損傷，CA可能參與這一損傷過程，AMPT可明顯減輕肺損傷。

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(本文編輯：趙麗潔)

Effects of catecholamines on lung injury induced by restraint stress in rats

LI Li1, ZHANG Xiao-jing2, LIU Wei3, SONG Ning4, YU Chang-li1*

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China; 2.DepartmentofForensicMedicine,HebeiMedicalUniversity,HebeiKeyLaboratoryofForensicMedicine,Shijiazhuang050017,China; 3.DepartmentofOrthopedics,HebeiChestHospital,Shijiazhuang050042,China; 4.DepartmentofInfectiousDisease,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Objective To study the effect of catecholamine(CA) on lung injury in rats with restraint stress. Methods Fifteen adult male SD rats were randomly divided into control group, restraint stress group and restraint+alpha-methyl-p-tyrosine(AMPT) group, 5 rats in each group. Both plasma norepinephrine(NE), epinephrine(E) and interleukin-1 beta(IL-1β), interleukin-6(IL-6) concentration were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Hematoxylin-eosin(HE) staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. The protein levels in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were detected by bicinchoninic acid method. Results Compared with the control group, the plasma NE and E levels in the restraint stress group, restraint+AMPT group were significantly higher than those in the control group. Compared with the restraint stress group, the levels of NE and E in plasma of the restraint+AMPT group were significantly lower than those in restraint stress group(P<0.05). Compared with the control group, the levels of IL-1β, IL-6 in the lung tissue and BALF protein content of the restraint stress group and restraint+AMPT group were significantly increased. Compared with the restraint stress group, the levels of IL-1β, IL-6 and BALF in the lung tissue of the restraint+AMPT group were significantly decreased, the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion Catecholamine may be involved in the lung injury induced by restraint stress. AMPT can significantly reduce the lung injury induced by restraint stress.

lung injury; catecholamine; restraint stress

2016-11-15；

2017-03-06

國家自然科學基金資助課題(81202382)

李莉(1989-)，女，河北石家莊人，華北理工大學附屬醫院醫學碩士研究生，從事呼吸內科疾病診治研究。

R563

A

1007-3205(2017)05-0501-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.002

*通訊作者