利用SSR和SFP標記分析水稻葉色突變體的多態性

劉明浩，肖 楠，方希林，陳茜霖，吳旺嬪，陳光輝,2，王 悅

（1.湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128；2.南方糧油作物協同創新中心，湖南 長沙 410128）

利用SSR和SFP標記分析水稻葉色突變體的多態性

劉明浩1，肖 楠1，方希林1，陳茜霖1，吳旺嬪1，陳光輝1,2，王 悅1

（1.湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128；2.南方糧油作物協同創新中心，湖南 長沙 410128）

利用1 286對SSR標記和66對SFP標記對水稻轉綠型新葉黃化突變體ygr和正常綠葉水稻品種日本晴（NBP）的基因組進行多態性研究。結果表明：1 236對SSR標記和63對SFP標記有擴增產物，擴增效率為96.08%；親本間共篩選到248對SSR多態標記和12對SFP多態標記，平均每條染色體有22對，多態檢出率為19.23%；多態標記覆蓋水稻基因組達1 626.2 cM，相鄰多態標記間平均遺傳距離為6.25 cM。不同類型標記間比較發現，SSR標記的多態檢出率比SFP標記高1.1個百分點，兩者相差不大。

水稻；SSR標記；SFP標記；葉色；多態性

分子標記技術在水稻功能基因定位、分子標記輔助選擇育種以及遺傳多樣性分析等研究中具有重要作用。20世紀90年代以來，分子生物學的迅速發展，水稻品種93-11 和日本晴測序的完成，加速了水稻分子標記的開發和應用。不同類型分子標記的開發對水稻功能基因的定位和克隆具有重要意義。簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）也稱微衛星標記，覆蓋了水稻的整個基因組，具有數量多、高多態性、呈共顯性等優點。Ouyang等[1]研究表明，水稻基因組含有18 828個SSR分子標記。目前，這些SSR分子標記在水稻功能基因圖位克隆和分子標記輔助選擇育種的研究中得到廣泛應用。SFP標記（single feature polymorphism，SFP）是近年來開發出來的一種基于微陣列技術的基因組插入/缺失差異標記。Edwards等[2]根據基因組插入/缺失差異，開發出880個SFP標記，這些標記也被廣泛用于水稻功能基因的研究中。

水稻產量的90%～95%來自光合作用，提高光能利用率，是發揮水稻產量潛力的重要途徑之一。葉色突變體是開展水稻光合作用機制、葉綠體結構功能及發育調控機理等基礎研究的理想材料。不斷發掘和鑒定新的尤其是實用型的水稻葉色突變基因，有助于在生產應用中提高雜交水稻種子的生產質量，進一步揭示水稻光合作用分子機理。該研究旨在找出轉綠型新葉黃化突變體（ygr）和日本晴（NBP）親本間呈現多態性的分子標記，比較SSR和SFP兩種標記的多態檢出率，并探討多態性標記的分布規律，以期為進一步定位及克隆突變基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

轉綠型新葉黃化突變體ygr和正常綠葉品種NBP，均由湖南農業大學水稻研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 育 苗 供試的ygr和NBP種子，預先在37℃浸種（兩干兩濕），露白后，播種于塑料育秧盤中。育苗土為市面上購買的營養土，溫室育苗。

1.2.2 水稻基因組DNA的提取及PCR擴增 水稻基因組DNA的提取參照McCouch的方法，略有改進[3]。PCR擴增體系（10 μL）：DNA 模板（20 ng/μL）1 μL，引物（2 pmol/μL）1 μL，10×Buffer 1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.2 μL，rTaq酶（5 U/μL） 0.1 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min：95℃變性30 s，55～58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃再延伸7 min，4℃保存。電泳及檢測：在每管PCR產物中，加入2 μL Loading Buffer（指示劑）。以50 bp梯度的DNA Ladder為對照，以0.5×TBE為電泳緩沖液，150V恒壓電泳1.5～2.0 h，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳分離。銀染程序根據Sanguinetti等[4]的方法改進而成。

1.2.3 標記來源 選擇均勻覆蓋水稻全基因組的1 286對SSR標記和66對SFP標記，檢測ygr和NBP之間的多態性。其中，SSR標記及其序列信息來自McCouch、國際水稻基因組測序計劃等發表的文獻和Gramene數據庫（http://www.gramene.org/）[5]，SFP標記的設計方法和序列信息參見Edwards等[2]發表的文獻。所有的標記由上海英濰捷基生物公司和湖南華擎生物技術有限公司合成，-20℃保存。

1.2.4 數據分析 利用多態標記檢測ygr和NBP親本間多態性，“1”代表同ygr相同的帶型，“2”代表同NBP相同的帶型，“-”代表帶型不清或缺失的帶型。連鎖圖譜采用MapDraw 2.1軟件繪制[6]。

2 結果與分析

2.1 供試SSR和SFP標記在12 條染色體上的分布

在ygr和NBP親本間，共檢測1 352對分子標記的多態性，其中SSR標記有1 286對，SFP標記有66 對，共覆蓋水稻全基因組1 857.6 cM，平均每條染色體約有113對。由表1可知，在水稻全基因組12條染色體上，6號染色體標記分布最多，有133對，其次是3號染色體，有121對，而12 號染色體上的分子標記最少，只有99對。所有染色體上，SSR標記的擴增率都在90%以上，而SFP標記在3、5、8號染色體上的擴增率均為83.33%，其他染色體上擴增率為100%（表1）。

表1 SSR和SFP標記在水稻12條染色體上的分布

2.2 SSR和SFP標記多態性檢出率的比較

由表1可知，有260對分子標記在ygr和NBP親本間呈現多態性。其中，SSR標記有248對，SFP標記有12對，平均每條染色體有22對多態標記，多態檢出率為19.23%。不同染色體之間比較，6號染色體篩選得到的多態標記最多，有34對；而7號染色體的多態性檢出率最高，達到26.61%。SSR標記的多態檢出率為19.28%，而SFP標記的多態檢出率為18.18%，兩者相差不大。

2.3 多態標記在圖譜上的分布

以ygr和NBP親本間檢測到的220 對多態分子標記構建水稻多態圖譜如圖1所示，多態標記覆蓋水稻全基因組1 626.2 cM，相鄰標記間遺傳距離為6.25 cM。其中，3號染色體上多態標記覆蓋距離最長，達229.9 cM；第11染色體的平均間距最大，達到11.14 cM；6號染色體的多態標記平均間距最小，為3.57 cM。此外，圖譜中尚有一些染色體位置多態標記覆蓋不夠均勻，如2號染色體SSR標記RM213至RM266之間相距41.7 cM，而3號染色體SSR標記RM5548至RM85之間相距70.9 cM。這些相鄰標記間距較大并不是因該染色體區段供試分子標記密度或者間距過大造成的，如1號染色體SSR標記RM582至RM5638之間37 cM區段內供試分子標記有26對，但是沒有在ygr與NBP親本間發現多態分子標記，因此，在有大量供試分子標記覆蓋的情況下，多態性可能與親本間基因組序列的同源性有關。

圖1 ygr與NBP親本間SSR和SFP標記的多態圖譜

3 討 論

SSR標記在水稻基因組內的數量豐富，呈共顯性，而且在利用過程中，操作步驟少而簡單，使其在構建遺傳圖譜和分子標記輔助選擇上，得到廣泛的應用。鮑根良等[7]研究顯示，SSR多態性的檢出率，與親本的親緣關系呈正相關，即兩個品種的親緣關系越遠，其多態的檢出率越高。因此，在構圖遺傳圖譜時，應該充分考慮兩個親本的親緣關系，最好選擇生態類型差異較大，或者親緣關系相差較遠的兩個親本。該研究以轉綠型新葉黃化突變體ygr和正常綠葉品種NBP為親本構建水稻多態圖譜，親本間多態性檢出率為19.23%，在包含260個多態標記的水稻多態圖譜中，1、2號染色體上各有1個，3號染色體上有2個大于30 cM的區段存在。這可能與親本之間在染色體部分區段的同源性有關。

SFP標記源于微陣列技術，是一種InDel標記。黃玲等[8]研究表明，SFP標記的擴增率和多態率，均要高于SSR標記，親本間的差異也要更加明顯。然而，該研究中SFP的多態檢出率為18.18%，略低于SSR的多態檢出率，這可能與親本間特異性相關。

隨著生物信息學的不斷發展，多態性分子標記的開發效率不斷提高，高密度遺傳圖譜的構建變得越來越容易，而且其相應的成本也越來越低。利用生物信息學，綜合使用各種類型的標記如SNP、Indel、ILP、STS、CAPS等，對靶區段進行加密，將獲得更加理想的遺傳圖譜，從而縮短目標基因（QTLs）的定位區間，為基因克隆奠定堅實的基礎。

[1] Ouyang S，Liu J，Jones K M，et al. The map-based sequence of the rice genome[J]. Nature，2005，436：793-800.

[2] Edwards J D，Janda J，Megan T，et al. Development and evaluation of a high-throughput，low-cost genotyping platform based on oligonucleotide microarrays in rice [J]. Plant Methods，2008，4（1）：13.

[3] McCouch S R，Kochert G，Yu Z H，et al. Molecular mapping of rice chromosomes[J]. Theoretical and Applied Genetics，1988，76（6）：815-829.

[4] Sanguinetti C J，Dias N E，Simpson A J. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels[J]. Biotechniques，1994，17（5）：914.

[5] Mccouch S R，Teytelman L，Xu Y，et al. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice（Oryza sativa L.）[J]. DNA Research，2002，9（6）：199-207.

[6] 劉仁虎，孟金陵. MapDraw在Excel中繪制遺傳連鎖圖的宏[J]. 遺傳，2003，25（3）：317-321.

[7] 鮑根良，富田桂，小林麻子，等. 粳稻品種SSR多態性檢出率的分析[J]. 中國農業科學，2005，38（12）：2549-2554.

[8] 黃 玲，黃紅梅，肖應輝，等. 利用SSR和SFP標記分析不同抗瘟性水稻品種的多態性[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版），2010，36（3）：267-271.

（責任編輯：成 平）

Polymorphism Analysis of Rice Leaf Color Mutant by SSR and SFP Markers

LIU Ming-hao1，XIAO Nan1，FANG Xi-lin1，CHEN Qian-lin1，WU Wang-pin1，CHEN Guang-hui1,2，WANG Yue1

（1.College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2.Collaborative Innovation Center of Paddy Crop and Oil Crops in Southern, Changsha 410128, PRC）

One thousand two hundred and eight six pairs of SSR markers and 66 pairs of SFP markers were used to find the genomic polymorphism between the new leaf yellowing mutant ygr and normal green leaf cultivar NBP. The results showed that 1 236 pairs of SSR markers and 63 pairs of SFP markers had amplification products and amplification efficiency was 96.08%. A total of 248 pairs of SSR polymorphic markers and 12 pairs of SFP polymorphic markers were screened. There were 22 pairs of polymorphic markers on each chromosome, and the polymorphism was 19.23%. Polymorphic markers covered 1 626.2 cM of the rice genome, and the average genetic distance was 6.25 cM between adjacent polymorphic markers. Compare by different types of markers, the polymorphism detection rate of SSR marker was higher than that of SFP marker by 1.1 percent point, with no significant difference.

rice; SSR markers; SFP markers; leaf color; polymorphism

Q343.1+7

A

1006-060X（2017）04-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.001

2017-02-22

國家自然科學基金（31301650）；湖南省教育廳優秀青年項目（16B127）；湖南農業大學大學生創新性實驗計劃項目（XCX1549）

劉明浩（1989-），男，山東臨沂市人，碩士研究生，研究方向：水稻分子育種。

王 悅