紫色紅曲霉M-35菌株產淀粉酶發酵條件和培養基配方的優化

許楚旋，江 北，張 琪，吳巧玉，蔣冬花

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004）

紫色紅曲霉M-35菌株產淀粉酶發酵條件和培養基配方的優化

許楚旋，江 北，張 琪，吳巧玉，蔣冬花

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004）

以實驗室前期從紅曲米中篩選的高產淀粉酶紫色紅曲霉（Monascus purpureus）M-35菌株為研究對象，將單因素試驗結果與響應面分析法相結合，對M-35菌株的發酵條件和培養基配方進行優化。搖瓶發酵單因素試驗優化了培養溫度、初始pH值、碳源種類和含量、氮源種類和含量、金屬離子種類和含量等。采用Minitab 17軟件的P-B試驗設計法，篩選對淀粉酶活有顯著影響的因素為：淀粉含量、蛋白胨含量和NaCl含量。根據P-B試驗結果，運用響應面法分析，確定M-35菌株產淀粉酶優化的培養基配方為：淀粉含量7.5%，蛋白胨含量4.0 %，NaCl含量0.5 %；在此條件下，淀粉酶活最高為276.14 U/mL，較優化前提高約1.57倍。利用優化的培養基配方和條件進行5L發酵罐發酵試驗，結果表明，M-35菌株發酵80 ～116 h，淀粉酶活可穩定在296 U/mL左右。

淀粉酶；紫色紅曲霉；響應面；發酵條件；培養及配方；優化

紅曲霉（Monascus）是腐生真菌，廣泛存在于泥土、植物組織、河川表面沉淀物以及糧食谷物等物質中；其生長適宜溫度在32～35℃之間，適宜pH值在3.5～6.0之間，尤其在酸性環境中生長旺盛[1]。紅曲霉是我國重要的食用、藥用真菌，是傳統中藥紅曲的基原菌，也是制作傳統飲品紅曲酒的主要菌種，被廣泛應用于食品發酵、食品著色、中藥配伍等領域[2-3]。紅曲霉生長過程中能產生多種酶，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶等，這些酶在制藥和調味品加工過程中起著非常重要的作用[4-5]。

淀粉酶廣泛存在于微生物和動植物體內，可以將淀粉水解形成糊精、低聚糖和葡萄糖等低分子物質，改善制品的風味；另外，由其作用生成的葡萄糖又可以進一步異構化成果糖，得到商品化的高果糖漿。目前，研究較多的產淀粉酶微生物有芽孢桿菌[6-7]、根霉、曲酶[8-9]等，關于紅曲霉產淀粉酶的研究報道相對較少[10-11]。因此，該研究以實驗室前期從自然發酵紅曲米中篩選獲得的高產淀粉酶優質菌株為材料，通過培養基配方和培養條件的優化，提高其淀粉酶產量和酶活，為進一步發掘和利用紅曲霉資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 紫色紅曲霉（Monascus purpureus）M-35菌株（以下稱M-35菌株），為實驗室前期從紅曲米中篩選到的高產淀粉酶優良菌株。

1.1.2 培養基 （1）PDA培養基：馬鈴薯20%、葡萄糖2.0%、瓊脂1.8%、pH值5.5；用于M-35菌株的常規培養和活化。（2）種子培養液：可溶性淀粉5.0%、蛋白胨2.0%、NaCl 0.5%、pH 值5.5；用于M-35菌株的種子培養。（3）發酵基礎培養液：可溶性淀粉（碳源）5.0%、蛋白胨（氮源）2.0%、NaCl（金屬離子）0.5%、pH值5.5；用作M-35菌株培養基配方和發酵條件優化的基礎培養基。（4）5 L發酵罐發酵培養液：可溶性淀粉7.5%，蛋白胨4.0%，NaCl 0.5%、pH值6.0；用于M-35菌株的5 L發酵罐培養。

1.1.3 3, 5-二硝基水楊酸試劑（DNS）試劑及其配制標準DNS試劑的配制參照《食品成分分析手冊》的方法，用于還原糖含量的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 M-35菌株的培養和粗酶液制備 將保存的M-35菌株接種到PDA培養基上，28℃恒溫活化培養5 d；用8 mm的打孔器取6個菌餅接入50 mL種子培養液（200 mL三角瓶）中，置于30 ℃、180 r/min的搖床培養4 d，用作種子液；將種子液按5%的體積接種到發酵培養液中，30 ℃、180 r/min的搖床培養6 d。培養液在4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液即為淀粉粗酶液。

1.2.2 粗酶液淀粉酶活的檢測 用DNS法測定酶反應后生成的還原糖量（以葡萄糖為標準），以此來檢測粗酶液淀粉酶活性，具體方法如下：在20 mL試管中加入2 mL 5 %（W/V）可溶性淀粉懸液和2 mL 0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH值5.0），將混合液在40℃的水浴環境中提前預熱10 min；加入1 mL淀粉酶粗酶液，40℃水浴反應1 h，水浴過程中不斷搖動；加入2 mL DNS試劑終止反應，將混合液置于沸水浴中煮沸5 min，待溶液冷卻后，加入蒸餾水定容至20 mL；在520 nm波長下，用分光光度計測量溶液的吸光值，參照葡萄糖標準曲線計算生成的還原糖含量，計算紅曲霉M-35菌株產淀粉酶的酶活。淀粉酶酶活的定義：在以上反應條件下，1 min釋放1 μg葡萄糖的酶量定義為一個活力單位。

1.2.3 培養條件的單因素優化 （1）培養溫度：將保存的M-35菌株接種到PDA培養基上，28 ℃活化培養6 d；用8 mm的打孔器取6個菌餅接入50 mL種子培養液（200 mL三角瓶）中，30 ℃、180 r/min搖床培養3 d后；將種子液按5%的體積接種到發酵基礎培養液中，分別置于24、26、28、30、32和34 ℃溫度下，180 r/min搖床培養6 d；培養液在8 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。每個處理設3次重復，根據紅曲霉菌株淀粉酶活的檢測方法，參照葡萄糖標準曲線和淀粉酶酶活的定義分析不同培養溫度對淀粉酶酶活的影響。（2）初始pH值：調節發酵培養基初始pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。每個處理設3次重復，接種、培養、酶活檢測等方法同培養溫度。

1.2.4 培養基配方的單因素優化 以發酵基礎培養液為基礎，替換碳源、氮源、金屬離子等，探討培養基配方對M-35菌株產淀粉酶的影響。（1）碳源種類：木糖、淀粉、甘油、蔗糖、麥芽糖；（2）碳源（淀粉）含量：2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%；（3）氮源種類：氮源：氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、尿素、硝酸銨；（4）氮源（蛋白胨）含量：2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%；（5）金屬離子種類：鎂離子、銅離子、鈣離子、錳離子、鈉離子、鉀離子；（6）金屬離子（NaCl）含量：0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7% 。每個處理設3次重復，接種、培養、酶活檢測等方法同培養溫度。

這是我人生中第一次替父親抽號。那是2011年的夏天，巨浪牧場2號樓竣工。農場場部機關會議室人聲鼎沸、座無虛席。父親早已激動得不知邁哪條腿走路，還是母親比較淡定：“二樓好，更上一層樓嘛！”

1.2.5 培養基配方的Box-Behnken試驗設計 在單因素優化試驗的基礎上設計自變量為淀粉含量（%）、蛋白胨含量（%）和NaCl含量（%），分別用A、B、C代表，每個自變量又有低、中、高水平編碼值分別為-1、0、+1，發酵液中淀粉酶活為響應值。試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計的因素水平

1.2.6 培養基配方的響應面優化 采用Stat-Ease Design-Expert 8.1中的Box-Bennken試驗設計法優化培養基配方。

1.2.7 M-35在發酵過程中的生長曲線及產淀粉酶規律 利用優化的培養基配方和條件進行5 L發酵罐發酵試驗，測定M-35菌株在5 L發酵罐中的生長曲線及產淀粉酶規律。

（1）生長曲線的測定。一是M-35菌株的培養：將保存的M-35菌株接種到PDA培養基上，28 ℃活化培養6 d；用8 mm的打孔器取6個菌餅接入50 mL種子培養液（200 mL三角瓶）中，置于30 ℃、180 r/ min下搖床培養3 d，用作一級種子液。將一級種子液按5%的體積接種到發酵基礎培養液，30 ℃、180 r/ min搖床培養2 d，用作二級種子液；將二級種子液按20%的體積接種到5 L發酵罐發酵培養液發酵。二是菌絲干重的測定：50 mL空離心管放于在85℃的烘箱中烘干，稱取空離心管質量為m；每管吸取10 mL發酵液，在4 ℃，10 000 r/min離心10 min，棄上清；無菌蒸餾水洗3次，10 000 r/min離心10 min，棄上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，稱取質量為M；菌絲干重=M-m。每隔4 h取10 mL發酵液（每個時間點設3個平行試驗組，求平均值；取樣后補加相同體積發酵培養基）測定菌絲干重。以發酵時間為橫坐標，菌絲干重為縱坐標繪制生長曲線。

（2）產淀粉酶曲線的測定。每隔4 h取10 mL發酵液，檢測淀粉酶活大小，酶活檢測設3個平行試驗組，求平均值。以發酵時間為橫坐標，淀粉酶活為縱坐標繪制淀粉酶產生曲線。

2 結果與分析

2.1 M-35菌株培養條件的優化

（1）培養溫度：結果見圖1A，當培養溫度為30℃時，產淀粉酶活最高，為176 U/mL。因此，M-35菌株產淀粉酶后續培養溫度用30℃。

2.2 M-35菌株培養基配方的優化

（1）碳源種類：結果見圖2A，碳源為淀粉時，M-35菌株產淀粉酶活最高。

（2）碳源（淀粉）含量：結果見圖2B，當淀粉含量為7.5%時，M-35菌株產淀粉酶活達最大。

（3）氮源種類：對M-35菌株產淀粉酶活性的影響如圖3A所示，氮源為蛋白胨時，M-35菌株產淀粉酶活最大。

（4）氮源（蛋白胨）含量：蛋白胨含量對M-35菌株產淀粉酶活性的影響如圖3B所示，當蛋白胨含量為4.0%時，M-35菌株產淀粉酶活最大。

（5）金屬離子種類：對M-35菌株產淀粉酶活性的影響如圖4A所示，鈉離子對M-35菌株提高淀粉酶活具有較好的促進作用。

（6）NaCl含量：對M-35菌株產淀粉酶活性的影響如圖4B所示，當NaCl的含量為0.5%時，M-35菌株產淀粉酶活最大。

2.3 響應面優化M-35菌株的培養基配方

圖1 培養溫度和培養基初始pH值對M-35菌株產淀粉酶活性的影響

圖2 碳源種類和碳源含量對M-35菌株產淀粉酶活性的影響

圖3 氮源種類和氮源含量對M-35菌株產淀粉酶活性的影響

圖4 金屬離子種類和NaCl含量對M-35菌株產淀粉酶活性的影響

2.3.1 模型方程的建立與顯著性檢驗 利用SAS8.1軟件對Box-Behnken 試驗設計結果（表2）進行二次線性回歸擬合，得到數學模型：Y=275.38-7.17A-4.39B+0.47C+4.82AB+4.27AC-1.20BC-13.60A2-14.88B2-7.76C2。由表3可知，該模型F值極顯著（P＜0.01），R2=0.990 4，說明該模型能解釋99%響應值的變化；復相關系數，進一步說明該模型擬合度較好；失擬合不顯著（P＞0.05），說明二次線性回歸方程高度顯著，能較好的預測響應值Y。從響應值F值可知，各因素對淀粉酶活性影響因素顯著性順序為：淀粉含量＞蛋白胨含量＞NaCl含量。

2.3.2 培養基配方的響應面優化分析圖 響應圖和等高線圖由SAS8.1軟件分析得出，可以直觀反映出各個因素與響應值的交互作用。

（1）蛋白胨含量與淀粉含量的響應面：由圖5可知，當蛋白胨含量在（3.0，4.0）區間，淀粉含量在（5.0，7.5）區間內，淀粉酶活性隨著兩者含量的升高而升高，呈現正相關。當蛋白胨含量在（4.0，5.0）區間，淀粉含量在（7.5，10）區間內，淀粉酶活性隨著兩者含量的升高而降低，呈現負相關。

（2）NaCl含量與淀粉含量的響應面：由圖6可知，當NaCl含量在（0.4，0.5）區間，淀粉含量在（5.0，7.5）區間內，淀粉酶活性隨著兩者含量的升高而升高，呈現正相關。當NaCl含量在（0.5，0.6）區間，淀粉含量在（7.5，10.0）區間內，淀粉酶活性隨著兩者含量的升高而降低，呈現負相關。

（3）蛋白胨含量與NaCl含量的響應面：由圖7可以看出，當NaCl含量在（0.4，0.5）區間，蛋白胨含量在（3.0，4.0）區間內，淀粉酶活性隨著兩者含量的升高而升高，呈現正相關。當NaCl含量在（0.5，0.6）區間，蛋白胨含量在（4.0，5.0）區間內，淀粉酶活性隨著兩者含量的升高而降低，呈現負相關。

2.3.3 模型結論 為確定最佳點，再對數學回歸模型求一階偏導，得到優化的培養基配方為：淀粉含量7.5%，蛋白胨含量4.0%，NaCl含量0.5%，淀粉酶活性達到276.14 U/mL。經3次試驗驗證，在此條件下發酵液的淀粉酶活性達到275.92 mg/L。這表明在該試驗條件下建立的數學模型準確可靠，試驗實際值和預測值擬合度較好。

表2 Box-Behnken 試驗設計結果

表3 回歸方程統計分析結果

2.4 M-35菌株在發酵過程中的生長曲線及產淀粉酶產生規律

2.4.1 生長曲線 由圖8可知，0～8 h為M-35菌株的延滯期，延滯期很短；8～60 h為對數期，當發酵培養60 h時，M-35菌株的生物量最大為 43.16 g/L；60～96h是M-35菌株生長的穩定期，96 h以后開始進入衰亡期。

圖5 淀粉酶活關于蛋白胨含量與淀粉含量的響應面（左）與等高線（右）

圖6 淀粉酶活關于NaCl含量與淀粉含量的響應面（左）與等高線(右)

圖7 淀粉酶活關于NaCl含量與蛋白胨含量的響應面（左）與等高線（右）

2.4.2 產淀粉酶曲線 由圖8可知，M-35菌株產淀粉酶活性的高低隨著菌株的生長不斷變化，0～80 h產淀粉酶活性不斷增加；80～116 h，M-35菌株產淀粉酶活性基本穩定在296 U/mL左右，120 h以后，M-35菌株代謝速率降低，產生的淀粉酶活性也隨之降低。

3 結論與討論

以實驗室篩選的產淀粉酶紅曲霉M-35菌株為研究對象，探討了培養溫度、培養基pH值等條件以及培養基中不同碳氮源、金屬離子和NaCl含量，對M-35菌株產淀粉酶的影響。結果表明，適宜培養溫度為30℃、培養基pH值為6.0，適宜碳氮源分別為淀粉和蛋白胨。當淀粉作為碳源時，產淀粉酶活性達到最大，高于其他碳源，表明淀粉酶可能是一種誘導酶，淀粉能夠誘導淀粉酶的產生，也有利于紅曲霉的生長。當蛋白胨作為氮源時，產淀粉酶活性達到最大，高于其他氮源。Box-Behnken 試驗設計結果表明，對M-35菌株產淀粉酶活影響較大的3個因素分別是淀粉含量、蛋白胨含量和NaCl含量，通過響應面分析和驗證，得出適宜液態產淀粉酶培養基配方為：淀粉7.5 %、蛋白胨4.0 %、NaCl 0.50 %。利用優化的發酵培養基配方，可降低淀粉酶的生產成本。

圖8 M-35菌株在發酵過程中的生長曲線及產淀粉酶曲線

有研究表明，不同類型的淀粉酶在優化培養條件下，可以提高淀粉酶的活性。盧爭輝等[12]研究表明，產堿性淀粉酶菌株的最適反應pH 值為9.5；夏媛媛[13]等將產淀粉酶的菌株置于最優條件下培養，其淀粉酶活性可達312 U/mL；孫海彥[14]等采用響應面法優化產淀粉酶菌株的培養條件，最終使淀粉酶活性增加了7.5倍；李鵬等[15]從海洋中篩選產淀粉酶的菌株，通過產酶培養條件的優化，產酶量增加了19.1%。該試驗單因素試驗結果與響應面分析法相結合優化淀粉酶活性達276.14 U/mL，較優化前提高約1.57倍。

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（責任編輯：成 平）

Fermentation Conditions and Medium Optimizing of Monascus purpureus Strain M-35 Producing High-yielding Amylase

XU Chu-xuan，JIANG Bei，ZHANG Qi，WU Qiao-yu，JIANG Dong-hua
（College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, PRC）

Single factor experiment and response surface methodology was combined to optimize the submerged culture conditions and medium for the production of amylase enzyme using Monascus purpureus strain M-35 as material, which had high yield of amylase and purified from the natural fermentation of red yeast rice. The culture temperature, initial pH, kind and content of carbon source, nitrogen source and content, variety of metal ions, and content were optimize by shake flask fermentation single factor experiment. Using Plackett-Burman (P-B) in Minitab 17, 3 significant effects (C content, N content and NaCl content) on amylase enzyme activity were screened out. According to the P-B experiment results and analysis of response surface methodology in Design Expert, the data showed that C content 7.5 %, N content 4.0 %, NaCl content 0.5%, and the maximum amylase enzyme activity was up to 276.14 U/mL under this condition. Fermentation experiment in 5 L fermenter results showed that amylase enzyme activity was up to 296 U/mL after 80-116 h fermentation using the optimal conditions.

amylase; Monascus purpureus; response surface methodology; fermentation conditions; culture and formulation; optimization

Q815

A

1006-060X（2017）04-0005-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.002

2017-02-13

國家自然科學基金（NO. 31570013；NO. 31270061）

許楚旋（1996-），女，浙江東陽市人，本科生，專業：應用微生物。

蔣冬花