鎘脅迫對兩種芒屬植物葉片抗氧化酶系統的影響

黃湘吉，楊友才

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

鎘脅迫對兩種芒屬植物葉片抗氧化酶系統的影響

黃湘吉，楊友才

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

以芒屬植物A0104和C0424兩個品種的幼苗為材料，采用水培的方式探討了Cd脅迫對芒屬植物葉片抗氧化酶系統的影響。結果表明：當Cd濃度為1～2 mg/L時，Cd脅迫對C0424的影響較小，當Cd濃度增加至3～4 mg/L時，C0424體內氧化應激加劇；而A0104在1～4 mg/L的Cd脅迫濃度下均發生了強烈的氧化應激反應。這表明C0424在Cd耐性方面優于A0104。

Cd脅迫；抗氧化系統；芒屬植物

土壤是人類賴以生存的自然資源，也是人類生態環境的重要組成部分。隨著社會的進步，在工業生產和日常生活中，重金屬的使用越來越頻繁，使用后的重金屬得不到有效的處理，隨意排放到環境中，大氣、土壤和地表水中的重金屬通過植物的富集再由食物鏈進入到人體內，會對身體造成不良影響，甚至威脅到人類的健康。因此，土壤重金屬污染成為現階段農業生產最為突出的問題之一[1]。重金屬在土壤中的形態變化復雜，常用的傳統修復方法可分為3大類：物理方法、化學方法和生物方法。其中，生物方法中的植物修復技術是目前研究的熱點。植物修復技術就是指利用對重金屬富集能力較強的植物吸收土壤中的重金屬污染物，然后將其轉移到植物地上部分，從而達到去除和降低土壤中重金屬含量的目的[2]。研究表明，芒屬植物能在鹽堿地中生長，說明其具有較強的抗逆性[3]；已有報道稱芒屬植物中的五節芒對鉛、鋅等金屬有較好的耐性和積累作用；同時，芒屬植物的生物量很高。因此，芒屬植物在重金屬污染土壤修復領域應用前景廣闊。

為了探討不同濃度的Cd脅迫對芒屬植物苗期生理生化指標的影響以及不同品種的芒屬植物對Cd的積累特征，選用A0104和C0424兩個品種作為對比，采用水培人為添加Cd的方式，培養30 d，測定各處理葉片POD、SOD、CAT的活性和MDA含量，進而分析Cd脅迫對這兩種芒屬植物生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物材料為芒屬植物A0104和C0424幼苗（株高5 cm左右，3片真葉），由湖南農業大學芒屬植物資源圃提供。

主要試驗試劑有硝酸、高氯酸、磷酸緩沖液、愈創木酚、過氧化氫、三氯乙酸、Met溶液、NBT溶液、EDTA-Na2溶液、核黃素溶液和Cd標準溶液；主要試驗設備有烘箱、恒溫水浴、制冰機、離心機、分光光度計、熒光燈、粉碎機、消解儀和ICPE-9000金屬原子檢測儀等；還有實驗室常用器材，如消解管、移液槍、移液管、容量瓶、燒杯、研缽、量筒、試管、指形管、小藥瓶和離心管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 將供試材料移栽到漂浮盆中，移栽完畢后，澆一次水，并向水中添加霍格蘭營養液。待幼苗正常生長10 d后，向培養液中添加Cd（以硝酸鎘的形式添加），使培養液中Cd濃度分別為0、1、2、3、4 mg/L，分別編號為CK、T1、T2、T3和T4處理。培養30 d后取樣，期間定時補充水分，保持培養液中Cd濃度不變。

1.2.2 SOD的測定 取0.5 g樣品清洗干凈，置于預冷的研缽，加入1 mL預冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5 mL，倒入離心管，在4℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液為酶提取液。取5 mL指形管4支，2支測定管，2支對照管，加入酶提取液（對照管加等量緩沖液），將1支對照管暗處理，其他管至于4 000 Lx熒光燈下反應20 min，在560 nm處測定吸光度。

式中，ACK為對照管（照光）的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為加入PBS的體積（mL）；Vt為測定時酶液的用量（mL）；W為樣品重量（g）。

1.2.3 POD的測定 取酶提取液0.1 mL加入磷酸緩沖液（0.05 mol/L）2.9 mL、2%H2O21 mL、0.05 mol/L愈創木酚1 mL，用加熱煮沸5 min的酶提取液作為對照。置于37℃的水浴中反應15 min，然后轉入冰浴，加入20%三氯乙酸2 mL終止反應，在470 nm處測定吸光度。

式中，ΔA470為反應時間內吸光度的變化；W為樣品重量（g）；t為反應時間（min）；VT為酶提取液總體積（mL）；VS為測定時取用的酶液體積（mL）。1.2.4 CAT的測定 取10 mL試管3支，分別加入0.2 mL酶提取液，然后加入磷酸緩沖液1.5 mL及蒸餾水1 mL，對照組在沸水浴煮沸1 min。然后向每個試管加入0.3 mL 0.1mol/L的H2O2，每加完一次立即計時，馬上在240 nm處測定其吸光度，每隔1 min讀數1次，共測4 min。

式中，ΔA240為反應時間內吸光度的變化；W為樣品重量（g）；t為反應時間（min）；VT為提取酶液總體積（mL）；VS為測定時取用酶液體積（mL）。

1.2.5 MDA含量的測定 取葉片樣品0.2 g加入1.6 mL10% TCA研磨成漿，倒入離心管在12 000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL 0.67% TBA，在沸水浴煮30 min，冷卻后離心，取上清液分別在450、532、600 nm處測吸光度[4]。

MDA濃度C(μmol/L)=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

MDA含量（μmol/g FW）=C×V/W

式中，V為提取液的體積（L），W為樣品重量（g）。

1.3 數據分析

試驗各項數據采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進行分析處理，采用單因素ANOVA法進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫對芒屬植物葉片SOD活性的影響

從圖1中可以看出，隨著Cd濃度的升高，A0104葉片中SOD活性呈逐步上升的趨勢，T4處理的葉片SOD活性達到最高值，約為CK的1.7倍。與A0104品種不同，C0424在T1和T2處理時，葉片SOD活性隨Cd濃度的升高而降低，隨后在T3、T4處理出現反彈，葉片SOD活性急劇升高，T4處理的葉片SOD活性最高，約為對照的1.5倍。

圖1 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片SOD活性

2.2 Cd脅迫對芒屬植物葉片POD活性的影響

如圖2所示，兩個品種葉片的POD活性均隨Cd濃度的增加而上升，T1處理的POD活性上升程度較輕，A0104和C0424分別比對照升高了29%和23%，當Cd濃度增加至4 mg/L（T4處理）時，A0104和C0424品種的POD活性分別是對照的2.6和1.5倍。

2.3 Cd脅迫對芒屬植物葉片CAT活性的影響

如圖3所示，不同Cd濃度處理對A0104和C0424葉片的CAT活性均有一定影響。隨著Cd處理濃度的升高，A0104葉片中CAT活性呈下降趨勢，當Cd濃度為2 mg/L時，葉片CAT活性下降率為10.62%，下降程度較輕；當Cd濃度上升至4 mg/L時，葉片CAT活性急劇下降，比對照下降了35.16%。而在C0424品種中，T1～T2處理的葉片CAT活性比對照有所提升，其中T2處理的CAT活性上升了26.57%；但當Cd濃度增加至3～4 mg/L（T3～T4處理）時，葉片中CAT活性明顯降低，其中T4處理的葉片CAT活性與對照下降了26.83%。

圖2 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片POD活性

圖3 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片POD活性

2.4 Cd脅迫對芒屬植物葉片MDA含量的影響

從圖4中可以看出，隨著Cd濃度的升高，A0104品種葉片中MDA含量也隨之增加，葉片膜脂過氧化的程度隨之加深，T4處理的葉片MDA含量約為對照的2.1倍；與A0104相同，C0424品種葉片中MDA含量也隨環境中Cd脅迫濃度的升高而增加，T4處理的葉片MDA含量約為對照的1.7倍；但C0424葉片中MDA含量均低于A0104，除T3處理外，其他處理兩者之間MDA含量差異顯著。

圖4 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片MDA含量

3 結論與討論

植物能夠在一定的Cd脅迫范圍內正常生長，同時積累一定量的Cd。植株抗氧化系統在清除活性氧、維持膜系統穩定中起到了非常重要的作用。隨著環境中Cd脅迫的逐漸加重，會導致植物MDA含量的增加，從而加深膜脂過氧化的程度，進而抑制植物的生長和發育[5]。

SOD存在于細胞的各組成部分中，它能夠消除新陳代謝過程中產生的有害物質[6]。試驗結果表明，A0104葉片中SOD活性隨Cd脅迫濃度的升高而增強，C0424則表現出先降后升的趨勢，在T1、T2處理時，C0424葉片SOD活性比對照低，說明C0424對低濃度的Cd脅迫適應性較強；當Cd脅迫濃度上升至3～4 mg/L時，葉片SOD活性隨之增強，說明Cd脅迫濃度大于2 mg/L（T2）后，C0424葉片開始產生大量的SOD用于解毒；兩個品種相比，C0424在試驗設計的4個濃度中SOD活性均小于A0104。由此可知，在Cd濃度為1～4 mg/L時，C0424對Cd的耐性要高于A0104。

POD是細胞內一種比較重要的抗氧化酶，細胞內外的POD均能參與H2O2的清除[7]。在重金屬脅迫下，植物葉片的過氧化物酶活性表現出增強的趨勢[8]。同時，POD在衰老細胞中含量較高，也可作為細胞衰老的標志之一。與前人的研究結果相似，A0104和C0424兩個品種葉片POD活性都隨著Cd脅迫濃度的升高而增強，說明Cd脅迫加速了兩個品種葉片細胞的老化進程。當Cd濃度為1 mg/L時，A0104葉片POD活性低于C0424，說明在該濃度下A0104葉片細胞衰老的速度低于C0424。當Cd濃度增加至2～4 mg/L時，A0104葉片POD活性急劇升高，說明高濃度（2～4 mg/L）的Cd脅迫加速了A0104品種葉片細胞衰老；而品種C0424的葉片POD活性則呈緩慢增強的趨勢，且低于A0104品種；這也說明C0424較A0104對高濃度的Cd環境更具耐性。

過氧化氫酶（CAT）是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，可以分解活性氧——羥基自由基，從而達到為機體解毒的作用。試驗結果表明，A0104葉片CAT活性隨著Cd脅迫濃度的升高而減弱；而C0424則表現出先升后降的趨勢，當Cd脅迫濃度為1～2 mg/L時，CAT活性高于對照，當Cd脅迫濃度＞2 mg/L時，CAT活性減弱；在不同Cd脅迫濃度下C0424葉片的CAT活性均低于A0104。

丙二醛（MDA）含量是植物細胞膜質過氧化程度的體現。丙二醛含量高，說明植物細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重。在逆境環境下，植物會發生膜脂過氧化；當植物體內存在過剩的活性氧自由基時，也能發生膜脂過氧化[9]。Cd脅迫會使葉片細胞發生膜脂過氧化，隨著Cd脅迫濃度的升高，膜脂過氧化反應加強，A0104和C0424都是如此。當Cd脅迫濃度為3 mg/L時，兩個品種之間的MDA含量差異不顯著（P＞0.05）；其他濃度時，A0104葉片MDA含量均高于C0424，也就是說A0104在Cd脅迫下葉片細胞膜脂過氧化的程度高于C0424。

植物的抗氧化系統在防御外界脅迫時起到了至關重要的作用[10]。總的來講，C0424在Cd脅迫環境下的適應性表現比A0104要好。在低濃度（1～2 mg/L）下，C0424基本上能夠適應，SOD、POD值與對照差別不大，而CAT稍微高于對照，這說明CAT在C0424適應低濃度Cd環境中起到了重要的作用；而A0104則表現為另一種情況，當Cd濃度為1～2 mg/L時，SOD、POD活性上升，與對照差異顯著，說明低濃度的Cd對A0104品種造成了一定的危害，激活了植株體內的氧化應激反應來對抗外界的Cd脅迫；當Cd濃度增加至3～4 mg/L時，C0424體內SOD、POD活性急劇上升，CAT活性明顯降低，說明高濃度的Cd抑制了C0424體內的CAT活性，從而使植株無法及時清除體內的活性氧自由基，導致SOD和POD活性的升高，氧化應激加劇。因此，在芒屬植物苗期Cd耐性方面，C0424要優于A0104。

[1] 邢艷帥，喬冬梅，朱桂芬，等. 土壤重金屬污染及植物修復技術研究進展[J]. 中國農學通報，2014，30（17）：208-214.

[2] 陳 靖，林振景，孟媛媛，等. 土壤重金屬污染的植物修復及超富集植物的研究進展[J].中國環境管理干部學院學報，2011，21（1）：69-71.

[3] 林 聰. 芒屬能源植物耐鹽性堅定與評價[D]. 長沙：湖南農業大學，2012.

[4] Wójcik M，Tukiendorf A. Glutathione in adaptation of Arabidopsis thaliana to cadmium stress[J]. Biologia Plantarum，2011，55（1）：125-132.

[5] Boominathan R，Doran P M. Organic acid complexation，heavy metal distribution and the effect of ATPase inhibition in hairy roots of hyperaccumulator plant species[J]. Journal of Biotechnology，2003，101（2）：131-146.

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[9] 劉家女，周啟星，孫 挺. Cd-Pb復合污染條件下3種花卉植物的生長反應及超積累特性研究[J]. 環境科學學報，2006，（12）：39-44.

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（責任編輯：成 平）

Effects of Cadmium Stress on Antioxidant Enzyme System in Leaves of Two Species of Miscanthus

HUANG Xiang-ji，YANG You-cai

（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking seedlings of Miscanthus A0104 and C0424 as materials, the effects of Cd stress on the antioxidant enzyme system of the leaves of Miscanthus was studied by means of hydroponics. The results showed that 1-2 mg/L Cd have less effect on the C0424 Cd stress, but when the concentration of Cd increased to 3- 4 mg/L, Oxidative stress increased in C0424 oxidative stress. And strong oxidative stress reaction happened in A0104 under 1- 4 mg/L Cd stress concentrations. It was concluded that the tolerance to Cd in C0424 is stronger than that in A0104.

Cd stress; antioxidant system; Miscanthus

Q945.78

A

1006-060X（2017）04-0039-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.011

2016-12-13

湖南省農業委員會2016年湖南重金屬污染耕地修復及農作物種植結構調整試點資金專項（湘財農指〔2016〕130號）

黃湘吉（1989-），男，湖南張家界市人，碩士研究生，研究方向農業生態學。

楊友才