應用分子標記輔助選育甘藍型油菜雜交種的可行性

倪西源，黃吉祥，柳寒，潘兵，趙堅義*

1

（1.浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所/植物有害生物防控國家重點實驗室省部共建培育基地，杭州310021；2.浙江大學農業與生物技術學院作物科學研究所，杭州310058）

應用分子標記輔助選育甘藍型油菜雜交種的可行性

倪西源1，黃吉祥1，柳寒1，潘兵2，趙堅義1*

1

（1.浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所/植物有害生物防控國家重點實驗室省部共建培育基地，杭州310021；2.浙江大學農業與生物技術學院作物科學研究所，杭州310058）

通過研究甘藍型油菜不育系和恢復系間的遺傳距離與雜種優勢的相關性，探討在應用油菜不育系選育雜交種過程中借助分子標記篩選理想恢復系的可行性。利用分布在甘藍型油菜19條染色體上的66個分子標記對2個不育系（湘油15A和MSL72A）和26個品種（系）進行遺傳多樣性分析，進而分析遺傳距離和雜種優勢的相關性。結果發現，66個分子標記共獲得254個多態性位點；聚類分析結果與品種（系）的區域特性相一致，26個材料被清晰地劃分為4個類群：長江中下游地區，黃淮區，歐洲冬油菜和歐洲春油菜；雜交種雙親間遺傳距離與超父本優勢的相關性達到極顯著水平，在湘油15A和MSL72A配制的F1雜種中，相關系數分別為0.647**和0.622**；此外，父本產量與雜種產量的相關性也達到極顯著水平，相關系數分別為0.732**和0.615**。總之，與不育系具有較遠的遺傳距離、分屬不同群組的恢復系容易配制出綜合性狀好、產量高的雜交組合；利用分子標記輔助篩選恢復系，可以提高選育獲得強優勢雜交組合的效率。

甘藍型油菜；雜種優勢；分子標記；遺傳距離；雜種優勢群

SummaryComparing to open-pollinated varieties,rapeseed hybrids had an obvious heterosis in seed yield and adaptation to environment.In the procedure of hybrid breeding,it is very important to select the male and female parents,which greatly affects the hybrid performance.For the traditional method of hybrid breeding,the selection of parent lines for combination is random, which lacks foreseeability of the hybrid performance.Application of marker-assisted selection(MAS)can enhance the efficiency and accuracy of the selection,and shorten the period of breeding program.Therefore,this study aims to introduce MAS into the procedure of hybrid breeding in rapeseed,and to enhance the efficiency of breeding elite hybrids with good performance.

In the present study,two male sterile lines and 26 cultivars(lines)were analyzed with 66 molecular markers.These makerswere distributed on 19 chromosomes ofBrassica napusand each chromosome contributed 2 to 4 markers.The two male sterile lines,MSL72A and Xiangyou 15A(XY15A),belong to a kind of genic male sterile(GMS)system named 9012A in rapeseed.The 26 cultivars(lines)included 19 semi-winter type cultivars(lines)from China,4 winter type and 3 spring type cultivars(lines) from Germany.Fifty-two hybrids were derived by crossing the two male sterile lines with the 26 cultivars(lines).A dendrogram was established based on UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)cluster analysis.Nei72 distance between two male sterile lines and 26 cultivars(lines)was calculated,and the correlation between genetic distance and heterosis of hybrid performance was analyzed.

The results showed that 254 polymorphic loci were derived from the 66 markers and each marker had a mean of 3.9 polymorphic loci.The mean genetic distance between XY15A and the 26 cultivars(lines)was 0.56,and the maximum and minimum genetic distances were 0.15 and 0.80,respectively.The mean genetic distance between MSL72A and the 26 cultivars (lines)was 0.58,and the maximum and minimum genetic distances were 0.28 and 0.84,respectively.The dendrogram and principal coordinate analysis of the two male sterile lines and the 26 cultivars(lines)showed that all the materials were divided into four primary groups,which were consistent with their geographical attribute.The four groups were the middle and lower reaches of Changjiang River,Huanghuai region,Europe spring type and Europe winter type.Correlation analysis indicated that the genetic distance based on molecular markers was significantly correlated with over male-parent heterosis of hybrid performance,and the correlation coefficients were 0.647**and 0.622**in hybrids derived from the two male sterile lines,XY15A and MSL72A，respectively.The seed yield of hybrids was also significantly correlated with the yield of male parents,and the correlation coefficients were 0.732**and 0.615**,respectively.

All the results indicate that the hybrid performance depends on the performance of parent lines and the genetic distance between the two parent lines together.It will be highly efficient in hybrid breeding by combining male sterile lines with elite restorers which should have good performance and enough genetic distance with male sterile lines.Therefore,we consider that molecular markers could be used to select restorers for male sterile lines in hybrid breeding of rapeseed and enhance the breeding efficiency.

國內外普遍認為，與常規油菜相比，雜交油菜對于提高品種產量、改善抗逆性和適應性方面具有明顯優勢。在雜交種選育中，科學地選擇親本配組是獲得強優勢組合的關鍵環節，因此，明確親本間遺傳差異與雜種優勢間的關系，可以提高雜交種選育的效率。親本間的遺傳差異是雜種優勢產生的前提，研究表明，親本間的遺傳距離與雜種優勢具有很高的相關性[1-6]，但也有研究認為，基于分子標記的遺傳差異性分析還難以用來預測作物的雜種優勢[7-9]。而借助分子標記技術構建具有一定遺傳差異的雜種優勢群，建立相應的雜種優勢利用模式，可以更高效、準確地選配組合。溫帶玉米的雜種優勢利用模式建立已有50多年，雜種優勢群的建立是雜交玉米大獲成功的關鍵之一[3]，其理論基礎和選育經驗對油菜和其他作物的雜交種選育工作是很好的借鑒[10]。

油菜的雜種優勢利用可通過雄性不育、自交不親和以及化學殺雄等多條途徑實現。其中，利用雄性不育系配制雜交種是應用最為廣泛的一種方法。為了劃分油菜不育系和父本品種（系）的遺傳類群，明確不育系（母本）和恢復系（父本）間遺傳距離與F1產量雜種優勢的關系，從而在雜交種選育過程中指導親本的選配，提高雜交種選育的預見性和效率，本研究選用均勻覆蓋在甘藍型油菜19條染色體上的66個分子標記，對2個油菜雄性不育系和26個油菜品種（系）進行遺傳多樣性檢測，分析了親本間遺傳距離與雜種優勢的關系，并探討了在油菜雜交種選育中應用分子標記指導F1組合選配、構建雜種優勢群的可行性，期望對油菜雜交種選育中親本的選擇提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究材料為2個甘藍型油菜雄性不育系和26個油菜品種（系）（表1），以及2個不育系與26個油菜品種（系）按不完全雙列雜交設計配制的52個雜交組合。不育系MSL72A是利用分子標記輔助技術，將德國NPZ-Lembke育種公司發明的MSL不育系統的相關育性基因通過連續回交導入浙江省主導品種“浙雙72”中，從BC3F2世代獲得兩型系和臨保系后雜交產生的全不育系。湘油15A（XY15A）是通過相同技術將9012A[11]不育系統中的2個不育相關基因導入湖南農業大學選育的雙低油菜品種“湘油15”中，從BC3F2世代獲得兩型系和臨保系后配制的全不育系。

表1 26個油菜品種（系）的類型、產地及其與2個不育系間的遺傳距離Table 1 Types of 26 rapeseed cultivars(lines)from different origins and the genetic distances between these cultivars(lines)and two male sterile lines

表1 （續）Continuation of Table 1

1.2 分子標記

本研究選用定位于甘藍型油菜SG遺傳圖譜上的標記[12]，在每個連鎖群上選取4～5個標記，共選用78個分子標記對28份DNA樣品逐一進行分析，這些標記均勻分布在甘藍型油菜的19個連鎖群上。

1.3 田間測產試驗

田間測產試驗分3組進行：編號1～9的品種（系）和分別與2個不育系配制的18個雜交組合（共27個材料）為第1組；編號10～18的品種（系）和分別與2個不育系配制的18個雜交組合為第2組；其余8個品種（系）和分別與2個不育系配制的16個雜交組合為第3組。每個組內3次重復，重復內材料隨機排列。各材料經苗床育苗后移栽，行距0.3 m，株距0.2 m，小區凈長3.5 m、寬1.6 m（包含1側排水溝寬度，約0.3 m）。多數試驗小區成熟時統一收割，晾曬3～4 d后人工脫粒，然后裝入尼龍網袋晾曬，稱量。

1.4 DNA提取及標記分析方法

苗期取2個不育系及26個品種（系）的葉片。每份材料從5株幼苗上取等量葉片，混合裝入離心管中。采用簡易十六烷基三甲基溴化銨法提取基因組DNA，各單株DNA樣品稀釋成10 ng/μL后作為聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）模板。PCR反應體系按倪西源等[13]所述的進行。擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠[w(丙烯酰胺)∶w(甲叉雙丙烯酰胺)=29∶1]電泳分離，銀染法顯色[14]，顯色完畢的凝膠用掃描儀掃描成電子圖片保存。

1.5 數據采集和分析

待小區種子完全干燥，篩去莖稈、果殼等雜質后稱量，小區產量為3個重復的平均數。每小區隨機取種子20 g左右用于千粒質量測定和含油量分析。千粒質量用BS-124S型電子天平稱量，精確到小數點后3位，每小區隨機抽樣稱量2次，各500粒相加，重復間差異不超過0.02 g。含油量用近紅外分析儀測定，取3次測定的平均值用于數據統計分析。

分子標記數據的統計以每條多態性帶型作為一個多態性位點，有帶賦值為1，無帶賦值為0，數據缺失賦值為9。利用NTSYSpc 2.1軟件計算遺傳距離，并進行聚類分析和主成分分析；以Dice遺傳相似系數（genetic similarity,GS）作為聚類的依據，采用Nei72遺傳距離（genetic distance,GD）作相關性分析。Dice遺傳相似系數的計算公式為GS=2Mij/(Mi+Mj)，其中，Mij是親本i和親本j共有的位點數，Mi和Mj表示親本i和親本j包含的位點數；Nei72遺傳距離的計算公式為GD=－ln GS[15]。聚類分析按非加權類平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA）進行。采用SPSS 11.5軟件分析遺傳距離與雜種優勢的相關性、父本產量與雜種產量的相關性。

1.6 雜種優勢的度量

本文采用中親優勢、超親優勢和超父本優勢，研究其與遺傳距離的關系。在計算中親優勢、超親優勢時，分別以品種“湘油15”和“浙雙72”的產量代表不育系湘油15A和MSL72A的產量。雜種優勢的計算公式如下：中親優勢=（F1值－雙親平均值）/雙親平均值×100%，超親優勢=（F1值－高親值）/高親值×100%，超父本優勢=（雜種產量－父本產量）/父本產量×100%[16-17]。

2 結果與分析

2.1 不育系和父本品種（系）的遺傳多態性

本研究共用78個標記對2個不育系和26個品種進行標記分析，最終選取66個電泳結果清晰、數據完整的分子標記檢測結果進行統計分析，共獲得254個多態性位點（表2），平均每個標記含3.9個多態性位點。

表2 本研究所用分子標記及其所在染色體和多態性位點數Table 2 Chromosome position and polymorphic traits of the molecular markers used

不育系湘油15A與26個父本的平均遺傳距離為0.56，與品種“湘油15”的遺傳距離最小（0.15），與德國冬油菜品系RS1647的遺傳距離最大（0.80），與其他24個父本間的遺傳距離在0.38～0.76之間（表1）。不育系MSL72A與26個父本的平均遺傳距離為0.58，與品種“浙雙72”的遺傳距離最小（0.28），與德國NPZ-Lembke公司提供的春油菜品系412205NPZ的遺傳距離最大（0.84），與其他24個父本間的遺傳距離在0.29～0.80之間（表1）。

2.2 不育系和父本的聚類分析及主成分分析

用66個分子標記的254個多態性位點數據，通過NTSYSpc 2.1軟件進行聚類分析，獲得2個不育系和26個品種（系）的聚類圖（圖1）。在相似系數0.56處分為2個大類：第1類包括所有長江中、下游共15個品種；第2類包括3個歐洲春油菜、4個歐洲冬油菜品種（系）和4個來自中國西安的育種材料。在相似系數0.64處第1類可細分為A、B、C、D 4組，MSL72A所在組和華雙3號之間以及與其他3組之間均有較大的遺傳差異，湘油15A與大多數長江中、下游的育成品種間遺傳差異相對較小。第2大類也可進一步分為黃淮區、歐洲冬油菜和歐洲春油菜3個亞類。主成分分析結果與系統聚類樹狀圖一致，較直觀清晰地將26個品種和2個不育系聚成4類（圖2），長江流域地區品種（A）與歐洲春油菜（D）的遺傳距離最遠，其次是歐洲冬油菜（C），與黃淮區油菜相對較近。

2.3 雜種優勢分析

田間測產結果（表3）表明：26個父本的小區產量在635～1 500 g之間，平均為1 055 g，其中不育系湘油15A的背景品種“湘油15”是1 222 g，而不育系MSL72A的背景品種“浙雙72”為1 500 g，在所有父本品種中產量最高；在分別與湘油15A（XY15A）和MSL72A配制的各26個雜交種中，其小區產量分別在1 046～1 682 g和1 090～1713 g之間，平均產量僅相差14 g。與MSL72A組合的千粒質量平均值（3.62 g）略高于湘油15A組合(3.49 g)，其平均含油量也高于湘油15A組合0.6百分點。

圖1 2個不育系和26個品種（系）的聚類圖Fig.1 Dendrogram of the 2 male sterile lines and 26 cultivars(lines)

圖2 2個不育系和26個品種（系）的主成分分析Fig.2 Principal coordinate analysis of the 2 male sterile lines and 26 cultivars(lines)

比較2個不育系各配制的26個雜交種，同時表現超親優勢的父本品種（系）是品6672、浙油50、中雙11、組52、浙大622、浙油18和PRINCE。其中，來自陜西油菜雜交中心的組52和歐洲冬油菜PRINCE本身的產量水平并不高（898 g和756 g），但與湘油15A所配組合的中親優勢分別達到26.07%和35.67%、超親優勢達到9.37%和9.82%；在MSL72A組合中，中親優勢和超親優勢分別達到31.2%和40.1%、4.9%和5.3%：說明品種（系）組52和PRINCE的配合力較高。反之，浙雙6號、浙油19、OASE、LOREUZ和412205NPZ 5個父本品種（系）的超親優勢均為負值，說明這5個父本材料的配合力不理想；在MSL72A組合中，超親優勢最強的3個組合（MSL72A×浙油50、MSL72A×中雙11和MSL72A×浙油18）正好也是產量最高的3個組合，而在湘油15A組合中，超親優勢最強的3個組合的父本是滬油15、浙油21和中雙7號，而產量最高的3個組合分別是用浙雙72、滬油15和浙油50配制的雜種。綜上所述，浙油50不但自身產量水平較高，而且一般配合力和特殊配合力都較好，可作為湘油15A和MSL72A這2個不育系的首選父本；另外，中雙11和浙油18與MSL72A配組，滬油15和浙雙72用作湘油15A的恢復系都是不錯的選擇。

2.4 遺傳距離與雜種優勢的關系

雙親間遺傳距離和雜種優勢的相關性檢測結果（表4）表明：不育系湘油15A配制的26個雜交種雙親之間的遺傳距離與中親優勢和超父本優勢分別呈顯著和極顯著的正相關，相關系數分別為0.419和0.647；而與超親優勢呈負相關，相關系數為－0.209，但未達到顯著水平。不育系MSL72A配制的雜交種親本間的遺傳距離與超父本優勢呈極顯著正相關，相關系數為0.622；與中親優勢和超親優勢分別呈正相關和負相關，但均未達到顯著水平，相關系數分別為0.237和－0.346。

對父本產量及其雜種產量間的相關性分析表明，父本產量與湘油15A和MSL72A雜種產量的相關性均達到極顯著水平，相關系數分別為0.732（P= 0.000）和0.615（P=0.001）。

表4 遺傳距離與雜種優勢的相關性檢測Table 4 Correlation analysis between genetic distance and heterosis of seed yield

3 討論

在甘藍型油菜親本間遺傳距離與產量雜種優勢的相關性研究中，前人的研究主要對油菜親本間遺傳距離與雜種產量的中親優勢或超親優勢的相關性做了分析。有研究發現，親本間基于分子標記的遺傳距離與雜種產量的中親優勢或超親優勢存在顯著的相關性，可以用于指導雜交種的配組[4-5]；同時，也有研究認為，分子標記可以用于油菜雜種優勢的預測[7-9]。本研究發現，親本間的遺傳距離與雜種產量的超父本優勢具有極顯著的正相關性，同時，父本產量與雜種產量間也存在極顯著的正相關。這表明在利用油菜不育系配制雜交組合時，應選用與不育系遺傳距離較遠且產量較高的品系作為父本。

雖然半冬性油菜與春油菜和冬油菜間存在較大的遺傳差異，但由于生育期差異較大的原因，造成以半冬性油菜不育系與春油菜或冬油菜恢復系配制的雜交組合產量明顯低于半冬性油菜不育系與半冬油菜恢復系配制的雜交組合產量。因此，春油菜和冬油菜品種不能直接用于選育強優勢雜交組合，但可以通過與半冬性油菜雜交來選育新的品系，從而提高現有育種群體內品系間的遺傳差異。

借助分子標記手段篩選與原有品種資源遺傳距離較大并且適宜本地環境生產的新群體，然后用于雜交組合的選育，有利于育種成功。在適宜長江下游區域的油菜品種群體中，導入冬油菜、春油菜或國內其他區域油菜的遺傳背景，通過田間適應性選擇和分子標記篩選，構建1個或多個與原有群體具有較大遺傳差異的新群體，然后在不同群體間選擇親本配制組合，最終選擇適宜本地生態環境條件的雜種優勢利用模式，在理論上是可行的。

4 結論

在利用油菜不育系選育雜交種的過程中，首先利用分子標記估算不育系與恢復系間的遺傳距離，然后選擇與不育系具有較大遺傳距離的優良恢復系來配制雜交組合，可以提高選育獲得強優勢雜交組合的效率。此外，在現有育種群體中通過雜交引入不同生態類型的遺傳背景，然后在后代中借助分子標記輔助篩選來逐步擴大育種群體品系間的遺傳差異，最終可以構建適宜的雜種優勢群和雜種優勢利用模式。

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Application of molecular marker in hybrid breeding of rapeseed(Brassica napus L.):A feasibility study.

NI Xiyuan1,HUANG Jixiang1,LIU Han1,PAN Bing2,ZHAO Jianyi1*(1.State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control/Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;2.Institute of Crop Science,College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University, Hangzhou 310058,China)

Brassica napus;heterosis;molecular marker;genetic distance;heterotic group

S 334.5

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.05.061

Journal of Zhejiang University(Agric.＆Life Sci.),2017,43(2):173-182

國家重點研發計劃項目(2016YFD0101300)；浙江省農業新品種選育重大科技專項（2016C02050-8）；浙江省植物有害生物防控重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地項目(2010DS700124-KF1506，2015-cxzt-05)。

趙堅義(http://orcid.org/0000-0002-6050-7335)，E-mail:2208086097@qq.com

（First author）：倪西源（http://orcid.org/0000-0002-2633-5234），E-mail:nixiyuan@yeah.net

2016-05-06；接受日期(Accepted):2016-07-27