葡萄籽原花青素對下肢動脈硬化閉塞癥的效應研究

陸 磊，馮 超，崔學兵，楊繼武，秦 燕，劉仁貴*

（1.大理大學第一附屬醫院外六科，云南大理 671000；2.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

葡萄籽原花青素對下肢動脈硬化閉塞癥的效應研究

陸 磊1，馮 超1，崔學兵1，楊繼武1，秦 燕2，劉仁貴1*

（1.大理大學第一附屬醫院外六科，云南大理 671000；2.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

目的：探討葡萄籽原花青素（GSPE）對下肢動脈硬化閉塞癥（LEASO）的防治作用，并初步探討其作用機制。方法:新西蘭雄性家兔30只，進行LEASO模型復制。隨機分為正常對照組（CON組）、模型組（LEASO組）和GSPE干預組（GSPE組）（0.5 g/kg），每組10只。于術后第4、8、12周檢測家兔血清TC（總膽固醇）及ox-LDL（氧化低密度脂蛋白）水平，第12周末檢測SOD、MDA含量。分別在術前及術后12周對各組家兔行右后肢Doppler檢查；第12周末行家兔雙后肢DSA。結果：與CON組比較，LEASO組家兔有跛行，見右后肢足趾甚至右足壞疽，GSPE組的肢體活動基本正常，未見壞疽；與LEASO組比較，GSPE組血清ox-LDL水平在第8、12周均明顯降低（P＜0.05）；第12周末，血清SOD活性升高的同時MDA下降（P＜0.05）。Doppler顯示GSPE組家兔股淺動脈遠端PV值較LEASO組明顯升高（P＜0.01）；DSA顯示GSPE組家兔右后肢股淺動脈僅呈節段性閉塞，遠端血管顯影良好，有側支循環建立。結論：GSPE對LEASO具有一定的防治作用，其機制可能是通過清除自由基、降低脂質過氧化水平等途徑實現的。

GSPE；下肢動脈硬化閉塞癥；抗氧化；防治作用

下肢動脈硬化閉塞癥（lower extremity arterio?sclerosis obliterans，LEASO）是一種常見的慢性肢體缺血性疾病，動脈粥樣硬化是其發病的基礎。隨著人類社會的發展和進步，人類飲食習慣和結構發生改變，生活質量提高，人均壽命延長，社會老齡化越來越明顯，LEASO的發病率也有明顯升高〔1〕。研究表明LEASO是一種以血管壁中脂質和蛋白質氧化為特征的高氧化應激狀態〔2〕。據此，有效清除氧自由基、抑制脂質過氧化水平就有可能減緩甚至阻止動脈硬化的發生。

葡萄籽原花青素（GSPE）是一種多酚化合物，具有多種生物學活性，尤其是它強大的抗氧化作用。本研究在成功建立實驗動物模型的基礎上觀察GSPE對下肢動脈硬化閉塞癥的防治效果并探討其機制，為該疾病的藥物治療尋找新的突破點。

1 材料與方法

1.1試劑、藥品超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、一氧化氮（NO）試劑盒，丙二醛（MDA）試劑盒、考馬斯亮蘭檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；GSPE（西安小草植物科技有限責任公司），其他均為常用化學試劑。嚴格按照試劑盒說明由專人進行各指標的檢測。

1.2實驗儀器及設備T6紫外分光光度計（北京普析）；18R高速冷凍離心機TGL-18R（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；全自動生化分析儀H7180型（日本日立）；Terason T3000便攜式彩色超聲多普勒儀（美國GE）；Allura CV20型數字減影血管造影X線機（荷蘭飛利浦）。

1.3分組及處理新西蘭雄性家兔30只，體重1.90～2.10 kg（大理大學動物實驗中心提供）。適應性飼養3 d后隨機分為正常對照組（CON組）、下肢動脈硬化閉塞癥模型組（LEASO組）及葡萄籽原花青素干預組（GSPE組），每組10只。CON組給予常規標準飼料，而LEASO組及GSPE組給予高脂飼料喂養。同時，GSPE組給予5%GSPE混懸液灌胃（0.5 g/（kg·d）），連續12周，而CON組和LEASO組給予同體積的生理鹽水灌胃。

1.4動物模型的制備高脂飼料喂養2周后，對LEASO組及GSPE組進行造模。20%烏拉坦（4 mL/kg）麻醉家兔后，于腹股溝區解剖右股動脈，結扎其側支及股深動脈，在快速阻斷股動脈血流后在股動脈前壁剪開一小口，向遠端插入2F Fogarty球囊導管直至膝關節處，擴張球囊之后來回拖動導管5次破壞股淺動脈內膜，7-0血管縫合線縫合股動脈切口。術后給予青霉素G肌注（40 000 U/kg），連續3 d。

1.5指標檢測

1.5.1 血清TC、ox-LDL水平測定 造模后第4、8、12周于家兔耳緣靜脈采血檢測血清總膽固醇（TC）及氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，由全自動生化分析儀檢測。

1.5.2 血清NO、SOD及MDA含量的檢測 第12周末自家兔下腔靜脈取血4 mL，4 500 r/min，離心10 min，保留血清備用。分別在550、630及532 nm波長處測定血清NO、SOD、MDA的含量。

1.5.3 血管彩色超聲多普勒探測 造模前及造模12周后分別對3組家兔行后肢血管彩色超聲多普勒檢查，檢測后肢股動脈血流情況，采集各組家兔后肢股動脈血流頻譜圖及峰值流速（peak systolic velocity，PV）。

1.5.4 肢體血管造影 造模12周末，行后肢動脈造影。觀察雙側股動脈血流情況，采集各組家兔后肢動脈造影圖。

1.6統計學處理數據采用SPSS 11.5統計軟件進行分析，結果用（均數±標準差）進行統計描述，采用方差分析進行三組間差異性比較，若差異具有統計學意義采用SNK法進行兩兩比較，檢驗水準定為0.05。

2 結果

2.1各組家兔血清TC水平與CON組比較，LEASO組和GSPE組血清TC水平于第4周明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。之后該兩組的血清TC水平持續維持于高水平。GSPE組的TC水平在第4、8、12周與LEASO組比較，無明顯差異，不具有統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組家兔血清TC水平的變化（mmol/L，

表1 各組家兔血清TC水平的變化（mmol/L，

注：與CON組比較▲P＜0.05；與LEASO組比較★P>0.05。

組別0周4周8周12周CON組1.38±0.21 1.41±0.17 1.37±0.36 1.52±0.48 LEASO組1.42±0.27 23.98±1.16▲24.27±1.03▲24.52±1.97▲GSPE組1.32±0.35 24.11±1.24★▲23.91±1.67★▲24.27±1.16★▲

2.2各組家兔血清ox-LDL水平與CON組比較，LEASO組血清ox-LDL水平于第4周開始升高，第8及第12周呈明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；GSPE組血清ox-LDL水平于第8及12周明顯低于LEASO組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組家兔血清ox-LDL水平的變化（mmol/L

表2 各組家兔血清ox-LDL水平的變化（mmol/L

注：與CON組比較★P＜0.05，與LEASO組比較▲P＜0.05。

組別0周4周8周12周CON組20.47±1.23 21.84±3.01 24.06±4.58 22.48±3.23 LEASO組21.03±1.82 26.21±2.41★50.31±6.21★56.27±4.36★GSPE組20.87±2.33 25.11±1.32★41.23±5.86★▲44.39±5.61★▲

2.3各組家兔血清NO、SOD、MDA含量與CON組比較，LEASO組、GSPE組造模12周后血清SOD活性及NO水平明顯降低，而MDA的含量升高（P＜0.05）；與LEASO組比較，GSPE組血清SOD活性及NO水平明顯上升，同時MDA的含量下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組家兔12周末血清MDA、SOD、NO含量的變化（

表3 各組家兔12周末血清MDA、SOD、NO含量的變化（

注：與CON組比較★P＜0.05；與LEASO組比較▲P＜0.05。

組別MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）NO/（nmol/mL）CON組LEASO組2.89±0.13 8.31±0.26★125.65±2.18 53.41±3.85★82.14±10.71 25.24±3.43★GSPE組7.68±0.42★▲89.88±2.11★▲37.28±2.62★▲

2.4各組家兔肢體血管彩色超聲多普勒探測結果顯示，實驗前各組家兔后肢股動脈遠端峰值流速（PV）值無明顯差異。造模12周后測定各組右后肢股動脈遠端PV值，GSPE組及LEASO組的股動脈遠端PV值較CON組明顯降低，差異明顯，有統計學意義（P＜0.05）；而與LEASO組比較，GSPE組家兔股動脈遠端PV值是其2倍以上，呈明顯的升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組家兔右后肢股動脈遠端峰值流速PV值（cm/s）

2.5各組家兔肢體血管造影各組家兔DSA結果顯示：CON組雙側股淺、股深動脈正常顯影；LEASO組右股深、淺動脈完全性閉塞，遠端無明顯血流，無明顯側支循環形成；GSPE組顯示股深動脈未見顯影，手術部位以下的右股淺動脈節段性閉塞，但遠端動脈顯影良好，并可見豐富的側支循環形成。見圖1。

圖1 各組家兔肢體血管造影圖

3 討論

動脈粥樣硬化是一可累及全身血管的彌漫性病變，LEASO是在全身性動脈粥樣硬化基礎上的肢體表現，越來越多的臨床和實驗研究表明動脈粥樣硬化的進展以多種不同的方式進行，無論從結構還是生物學觀點，都表現為一種動力學進程。國外報道40歲以后，每10年該病的發病率可增高2～3倍，55歲以上人群約有20%有不同程度的動脈硬化閉塞并可引發臨床癥狀〔1〕。目前，動脈硬化閉塞癥的病因不十分清楚，血管細胞、血細胞和脂蛋白之間的相互作用十分重要并摻雜其中。新近的研究顯示LEASO表現為一種高氧化應激狀態，以血管壁中脂質和蛋白質氧化為特征〔2〕，在此病理過程中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導的氧化應激扮演了重要角色〔3〕，ROS不僅氧化修飾低密度脂蛋白，促進泡沫細胞形成，而且其介導的脂質過氧化可破壞血管內皮細胞，致其功能障礙，從而促進動脈硬化的發生發展〔4-5〕。據此，筆者認為減少ROS的生成，減輕脂質的過氧化反應，就能減輕或抑制LEASO的發展。

GSPE極強的抗氧化及清除自由基的活性已得以證實，其在體內的抗氧化活性是維生素C的20倍，維生素E的50倍〔6〕。除其直接抗氧化作用外，它還可通過降低內外源性的氧化應激、保護內源性抗氧化物質而起到抗氧化損傷作用。此外，GSPE亦可捕獲水溶性物質（例如血清、動脈壁間質液等）中的ROS，清除自由基，抑制LDL（低密度脂蛋白）的氧化，發揮抗動脈硬化的作用〔7-8〕。如果GSPE通過清除氧自由基的生成，減輕脂質的過氧化反應，也就有可能減輕或抑制LEASO的發生發展進程。

本實驗通過飼喂家兔高膽固醇飼料及行球囊導管損傷血管內膜，成功建立LEASO的動物模型，同時給予GSPE進行干預。實驗結果顯示：造模第4周LEASO組及GSPE組血清TC水平均已明顯升高，之后一直維持在較高水平，與CON組比較均有顯著性差異（P＜0.05），表明高脂血癥的模型復制成功。但是GSPE組與LEASO組比較，兩組間則沒有差異，表明GSPE對血清血脂水平幾乎沒有影響，這一結果與部分文獻的報道相一致。然而，我們卻觀察到，GSPE組從第8周開始，血清ox-LDL水平有明顯下降，且整個實驗過程中，血清ox-LDL水平一直低于LEASO組，兩者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。ox-LDL由血漿中的LDL經過氧化修飾形成，是粥樣斑塊的特征性成分之一。ox-LDL能促使巨噬細胞吞噬大量脂質而成為泡沫細胞，而粥樣斑塊的主要成分正是泡沫細胞累積而成的脂質核心，并且ox-LDL具有高度的細胞毒性，可損傷血管內皮細胞，促進動脈硬化的發生與發展，是LEASO形成過程中的重要中介因素〔9-10〕。因此，GSPE抑制了血清LDL的氧化修飾，就能減緩或阻抑動脈硬化閉塞癥的發生與發展，從而有利于改善LEASO組家兔肢體的缺血癥狀。

家兔血清SOD活性，NO含量及MDA含量的測定顯示：GSPE組SOD活性、NO水平明顯升高，高于LEASO組，與此同時MDA含量明顯降低，差異明顯，具有統計學意義（P＜0.05）。SOD能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損害，SOD活性的高低間接反應機體清除氧自由基的能力；MDA是脂質過氧化的最終產物，可破壞細胞膜結構，引起細胞功能障礙，甚至死亡，其含量可反映機體內脂質過氧化的程度。實驗結果表明，GSPE有較強的清除氧自由基、減輕脂質過氧化反應的能力。正是由于GSPE的抗氧化作用，致使血清ox-LDL水平明顯低于LEASO組。影像學的資料也顯示：第12周，GSPE組家兔右后肢股動脈遠端峰值流速（PV）值較LEASO組明顯升高，是其2倍以上，說明GSPE干預后家兔右后肢缺血情況有了明顯改善；DSA則更直觀地顯示了GSPE組股動脈出現部分再通，遠端動脈顯影及豐富的側支循環建立，較LEASO組有了明顯改善。在實驗過程中也同時觀察到CON組家兔正常進食及活動，LEASO組家兔進食尚可，但活動明顯減少，有跛行現象，右后肢皮溫明顯降低，并可見右后肢足趾壞疽甚至右足壞疽。而GSPE組家兔與CON組家兔一樣正常進食及活動，無跛行，未見足趾壞疽，這些表現與上述影像學結果是相一致的。

綜上所述，GSPE干預能有效改善LEASO肢體的缺血癥狀，促進側支循環的建立，從而阻止或減緩LEASO的發生和發展，對該病表現出良好的防治效果，目前國內外尚未見相關研究及報道。其機制可能與其強大的抗氧化作用（如清除氧自由基、降低脂質過氧化水平等）有關，GSPE能否直接或間接促進側支循環的建立，則有待進一步的證實。

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Protective Effectof Grape Seed Proanthocyanidin Extracton Lower Extremity Arteriosclerosis Obliterans

Lu Lei1,Feng Chao1,Cui Xuebing1,Yang Jiwu1,Qin Yan2,Liu Rengui1*
（1.DepartmentofGeneral Surgery,The First Affiliated Hospitalof Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract（GSPE）on lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO）,and to preliminarily explore its action mechanism.Methods:30 male New Zealand rabbits were randomly divided into three groups with 10 animals each to duplicate LEASO model.They were normal control group（CON group）, LEASO model group,and GSPE group（0.5 g/kg）.The TC and ox-LDL in serum were assayed after operation for 4 th,8 th and 12 th week.At the end of 12th week,the contentof SOD and MDA were detected.The right posterior femoral artery blood flow was detected by color doppler ultrasound,and digital subtraction angiography（DSA）of the double posterior limbs in rabbit was conducted before the operation and after 12th week.Results:Compared with CON group,rabbits of LEASO group had claudication and thanatosis was found in both posterior limbs.GSPE group showed normal activity without thanatosis.Compared with LEASO group,GSPE group's serum ox-LDL level decreased significantly at the end of 8th,12th week after operation（P＜0.05）.The activity of serum SOD raised obviously while MDA decreased significantly（P＜0.05）.Compared with LEASO group,GSPE group showed higher PV of right posterior superficial femoral artery under the detection of color doppler ultrasound（P＜0.01）.Detection of digital subtraction angiography（DSA）showed that the distal vascular imaging of right posterior superficial femoral artery was good in GSPE group and visible abundant collateral circulation was established.Conclusion:GSPE had a prominent protective effect on LEASO via removing free radicals,reducing lipid peroxidation level,etc.

GSPE;lower extremity arteriosclerosis obliterans;antioxidation;protective effect

R285.5

A

2096-2266（2017）04-0036-05

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.010

（責任編輯 李 楊）

云南省教育廳科研基金資助項目（0900158）

2016-04-29

2016-12-29

陸磊，碩士研究生，主要從事普外基礎與臨床研究.

*通信作者：劉仁貴，主任醫師.