艾滋病相關DLBCL中EB病毒的感染情況分析

高 波，孫晶晶，段月勛，鄧 剛，楊 倩，王 霖，潘 云*

（1.大理大學臨床醫學院，云南大理 671000；2.云南省第一人民醫院，昆明 650100；3.云南省傳染病專科醫院，昆明 650301；4.昆明市第一人民醫院，昆明 650000；5.昆明市傳染病醫院，昆明 650200）

艾滋病相關DLBCL中EB病毒的感染情況分析

高 波1，孫晶晶2，段月勛3，鄧 剛1，楊 倩4，王 霖5，潘 云1*

（1.大理大學臨床醫學院，云南大理 671000；2.云南省第一人民醫院，昆明 650100；3.云南省傳染病專科醫院，昆明 650301；4.昆明市第一人民醫院，昆明 650000；5.昆明市傳染病醫院，昆明 650200）

目的：分析艾滋病相關彌漫性大B細胞淋巴瘤（AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma，HIV-DLBCL）中EB病毒的感染狀況，并探討其在HIV-DLBCL中的作用。方法：收集20例HIV-DLBCL組織作為實驗組，5例非HIV感染的DLBCL（non-HIV-DLBCL）、4例HIV陽性淋巴結反應性增生（HIV-reactive hyperplasia，HIV-RH）、5例HIV陰性RH（non-HIV-RH）均作為對照組。采用原位雜交的方法對EBER（EB病毒編碼的小RNA）的表達情況進行檢測。結果：HIV-DLBCL中EBER的總陽性率為30%（6/20）；non-HIV-DLBCL中EBER的陽性率為40%（2/5）；HIV-RH和non-HIV-RH中EBER均呈陰性。結論：EBV感染與部分DLBCL的發生有關，但EBV在HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中的作用是否具有差異還需進一步深入研究。

艾滋病相關彌漫性大B細胞淋巴瘤；EB病毒；EBER

獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immune Defi?ciency Syndrome，AIDS），即艾滋病，是指人體感染人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）后，造成機體免疫功能嚴重受損，發生機會性感染和惡性腫瘤等一系列臨床表現的綜合征。艾滋病相關淋巴瘤（AIDS-related lymphoma，ARL）是一組與HIV感染相關的異質性淋巴造血組織增殖性疾病，其本質為免疫細胞的惡變〔1〕。流行病學資料顯示，與普通人群相比，非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）的發病率在HIV陽性患者中顯著升高，比非HIV感染者發生NHL的機率高60~200倍〔2-3〕。ARL已逐漸取代Kaposi肉瘤，成為最常見的AIDS相關惡性腫瘤〔4〕。ARL的常見病理類型以中度惡性的彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-celllymphoma，DLBCL）和高度惡性的伯基特淋巴瘤（Burkittlymphoma，BL）為主，約占95%以上，還有一些罕見的亞型〔5〕。

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是雙鏈DNA病毒，基因組長172 kb，屬于人類皰疹病毒科γ亞科，具有嗜人類淋巴細胞的特性〔6-7〕。EBV在全世界的感染率高達90%，大多數人終身潛伏感染，機體免疫功能明顯下降等少數情況下，免疫系統和病毒之間的平衡失調，則可能引起惡性的淋巴細胞增殖性疾病。近年研究發現EB病毒與霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）、Burkitt淋巴瘤、NK/T細胞淋巴瘤等關系密切，EBV陽性的淋巴瘤被稱為EBV相關淋巴瘤〔8〕。張彥等〔9〕用EB病毒液在體外感染人外周血淋巴細胞，成功建立淋巴母細胞株，并發現EB病毒相關淋巴母細胞在免疫缺陷小鼠中具有致瘤性。EBV潛伏感染時，其DNA整合于宿主細胞核內，不表達或部分低表達，當機體免疫功能低下時，EBV變異株再感染，使大量EBV-DNA克隆片段整合至宿主DNA上，促進宿主細胞異常增殖，最終導致癌變。在BL、DLBCL、PCNSL、KSHV（+）PEL等淋巴瘤中均有不同程度的EBV感染，感染率約為60%~100%〔10〕。EBV陽性淋巴瘤臨床過程呈侵襲性，預后差〔11〕。

鑒于云南省為HIV感染的高發省份，探究ARL的發病機制十分必要，因此我們采用原位雜交的方法檢測HIV-DLBCL組織中EBER（EBV編碼的小RNA）的表達，探討EBV感染與HIV-DLBCL的發生是否存在相關性。

1 材料與方法

1.1組織標本收集2008至2013年度云南省多家醫院（大理大學附屬醫院、云南省傳染病醫院、昆明市傳染病醫院等）的艾滋病相關彌漫性大B細胞淋巴瘤（AIDS/HIV-related diffuse large B-cell lymphoma，HIV-DLBCL）手術或活檢石蠟包埋標本20例。對照組14例石蠟包埋標本也收集自上述醫院，分為3組，其中A組為5例非HIV感染的DLBCL（non-HIV-DLBCL），B組為4例HIV陽性淋巴結反應性增生（HIV-reactive hyperplasia，HIV-RH），C組為5例non-HIV-RH。20例HIV-DLBCL和5例non-HIV-DLBCL患者入院前均未進行治療。按照2008年WHO關于淋巴造血組織腫瘤的分類標準，由大理大學附屬醫院病理科2名高年資病理醫生對HE切片進行復核。

1.2主要試劑EBER原位雜交試劑盒購自福建泰普生物科學有限公司；蘇木素、伊紅購自美國Sigma公司；二甲苯、無水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、甲醛等試劑均購自天津風船化學試劑科技有限公司。

1.3核酸原位雜交標本均以4μm連續切片，65℃恒溫箱中烤片1 h，按照EBER原位雜交試劑盒的說明檢測EB病毒小RNA。以PBS代替雜交液做陰性對照，選用EB病毒陽性的鼻咽癌組織切片作陽性對照。

1.4結果判讀EBER原位雜交陽性表達定位于胞核，呈棕黃色細顆粒狀，陽性細胞比例≥5%為陽性，<5%為陰性。胞質和胞膜著色視為陰性。

1.5統計學分析采用統計學SPSS 17.0軟件對數據進行處理，對相關計數資料分析采用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1臨床資料分析20例HIV-DLBCL患者的臨床特點：男性15例，女性5例，男：女比例為3：1；年齡范圍29~66歲，中位年齡50歲，其中大于60歲者4例，占20%，小于等于60歲者16例，占80%，兩者之比約為0.25：1；原發于結內者14例，占70%，原發于結外者6例，占30%，兩者之比約2.3：1；其中結內原發于頸部淋巴結7例（7/14），腋窩淋巴結2例（2/14），腹股溝淋巴結者4例（4/14），其他部位淋巴結1例（14/14），結外原發于胃腸道5例（5/6），睪丸1例（1/6）；免疫分型：GCB型5例，占25%，nonGCB型15例，占75%；臨床分期早期（Ⅰ+Ⅱ）者7例（7/20），占35%，進展期（Ⅲ+Ⅳ）13例（13/20），占65%，兩者之比約為0.54：1。20例HIV抗體確認實驗均呈陽性。

對照組14例，男性9例，女性5例，男：女比為1.8：1；年齡27~72歲，中位年齡47.5歲。對照組：A組5例non-HIV-DLBCL，淋巴結內病變3例（頸部、腋下及后腹膜等處淋巴結），結外病變2例（頜下及大腿根部等處腫物）；B組4例HIV-RH，均為頸部淋巴結病變組織；C組5例non-HIV-RH，頸部淋巴結病變組織4例，腹股溝淋巴結病變組織1例。

2.2 EBER在各組樣本中的表達情況20例HIVDLBCL中EBER總陽性率為30%（6/20）。對照組14例樣本中EBER總陽性率為14.29%（2/14），A組5例non-HIV-DLBCL中EBER陽性率為40%（2/5），B組4例HIV-RH和C組5例non-HIV-RH中EBER均呈陰性。HIV-DLBCL與non-HIV-DLBCL中EBER的表達率明顯高于HIV-RH和non-HIV-RH，表明EBV感染與部分DLBCL的發生有關。見表1、圖1。

表1 EBER在各組樣本中的表達情況

圖1 免疫組化法檢測HIV-DLBCL中EBER陽性表達（核陽性）400x

EBER在HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中均有表達，但表達率較低，兩組腫瘤中EBER總陽性率為32%。HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中EBER表達率差異無統計學意義（P=1.000）。見表2。

何萬貫（2007）認為，寫作是一個過程，包含第一寫作過程和第二寫作過程。前者指學生收到寫作任務，完成后上交作文的過程；后者指學生收到批改過的作文并根據評語修改的過程。在第二寫作過程中，學生要分析并理解評語和反饋信息，重新組織與修改作文。這是一項高級認知活動，對提高作文質量至關重要（何萬貫，2007）。

表2 HIV/non-HIV-DLBCL組間EBER表達情況

3 討論

DLBCL是臨床特點、組織形態、免疫表型及分子遺傳學特征具有多樣性的侵襲性淋巴瘤，其分子發病機制錯綜復雜。與non-HIV-DLBCL相比，HIV-DLBCL在臨床上表現出更強的侵襲性。HIV感染有關的淋巴瘤更傾向于復雜的淋巴結外病變，部分ARL患者出現一些特殊部位的侵犯，如肺、口腔、腎上腺、腎臟、心臟、膽囊、耳垂及其他淋巴瘤可涉及的復雜部位都有報道〔12〕。

EBV的致癌機制仍未完全闡明，目前研究認為可能與以下幾點有關：①EBV對被其感染的B細胞有很強的轉化能力或永生化能力；②某些相關因素，如特異性免疫識別或免疫監視功能喪失、其他病原體感染激活B細胞異常增殖以及與環境因素等協同作用；③EBV轉化的B細胞出現繼發性基因突變或染色體易位等變化〔13〕。EBV在不同研究中表達率存在差異，盧璐等〔6〕發現EBER1在DLBCL中的陽性率為25.0%。孫文文等〔7〕對EBV Lmp-1蛋白與EBER1 mRNA在DLBCL中的陽性率僅為0.94%、5.7%。Castillo等〔14〕認為EBV陽性的DLBCL患者應該按照類似EBV陰性DLBCL患者的指導標準進行分期和管理，經化療免疫治療后，EBV陽性患者的預后更差。Tisi等〔15〕對218例DLBCL患者的全血樣本進行分析，在25%的患者全血中檢測到EBVDNA，EBV陽性患者經R-CHOP免疫化療后，無進展生存期和總生存期都明顯短于EBV陰性的患者。

AIDS相關淋巴組織增殖性疾病是一組出現在HIV感染伴隨免疫抑制狀態下的疾病，受EBV感染的淋巴細胞可以發生無限制的增殖。Martorelli等〔16〕證實HIV-1基質蛋白p17由被感染的細胞釋放并在淋巴組織中積累，可以與細胞受體CXCR1和CXCR2結合，B淋巴細胞中EBV感染或EBV LMP-1異位表達均可以上調CXCR2，增強細胞對p17結合和內化作用，同時在免疫缺陷群體中p17對EBV誘導的淋巴瘤發生具有促進作用。在30%~70%的HIV相關淋巴瘤病例中，可以檢測到EBV基因組，并且兩者的關系程度與淋巴瘤的組織病理類型相關〔17-18〕。PCNSL、免疫母細胞性（DLBCL）、PEL及其變異型、口腔PBLs等，均呈現EBV感染的特征〔2〕。

本研究結果與多數報道一致：EBV在HIVDLBCL中的表達率為30%，在non-HIV-DLBCL中的表達率為40%，與淋巴結良性病變組織中EBER的表達率具有明顯差異，提示EBV感染可能參與部分HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL的發生。但由于本研究中病例樣本量較小，尚未發現EBV在HIV-DLBCL與non-HIV-DLBCL發生機制中有意義的差異性。EBV因其對人類的普遍易感性、感染的潛伏性以及強烈的致癌性而對人類健康構成巨大威脅，EBV疫苗的使用或抗EBV治療對預防和治療淋巴瘤有積極的作用，因此分析淋巴瘤中EBV的感染情況具有重要意義。綜上所述，我們將在后續研究中擴大樣本量，進一步深入探討EBV在HIVDLBCL和non-HIV-DLBCL發病機制中的作用。

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Analysis on Epstein-Barr Virus Infection in AIDS-related Diffuse Large B-cell Lymphoma

Gao Bo1,Sun Jingjing2,Duan Yuexun3,Deng Gang1,Yang Qian4,Wang Lin5,Pan Yun1*
（1.College of Clinical Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.The First People's Hospitalof Yunnan Province, Kunming 650100,China;3.Infectious Diseases Hospitalof Yunnan Province,Kunming 650301,China;4.The First People's Hospital of Kunming,Kunming 650000,China;5.Infectious Diseases Hospitalof Kunming,Kunming 650200,China）

Objective:To analyze the Epstein-Barr Virus（EBV）infection and discuss the role of EBV in AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma（HIV-DLBCL）.Methods:20 cases of HIV-DLBCL were collected as experimentgroup.5 cases ofnon-HIVDLBCL,4 cases of HIV-reactive hyperplasia（HIV-RH）and 5 cases ofnon-HIV-RH were collected as control group.The expression of EBER（EBV-encoded RNA）was detected by in-situ nucleic acid hybridization.Results:The total positive expression rate of EBER in HIV-DLBCL and in non-HIV-DLBCL was 30%（6/20）and 40%（2/5）,respectively.EBER was negative in both HIV-RH and non-HIV-RH.Conclusion:EBV infection was involved in tumorigenesis of part of DLBCLs,butitneeds to be further studied on whether EBV functions differently in HIV-DLBCL and non-HIV-DLBCL or not.

AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma;Epstein-Barr Virus;EBER

R733.4

A

2096-2266（2017）04-0059-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.016

（責任編輯 董 杰）

國家自然科學基金資助項目（81660037）；云南省高校病理學科技創新團隊計劃支持項目（云教科〔2014〕22號）；云南省臨床重點專科建設基金資助項目（云財社〔2012〕311號）

2016-05-25

高波，助理實驗師，主要從事分子病理學研究.

*通信作者：潘云，教授．