XH02菌強化反應器脫氮過程中菌群結構的高通量分析

黃鄭鄭,曹 剛,2*,李紫惠,陳海升,莫測輝,2(.暨南大學環境學院,廣東 廣州 50630；2.廣東省污染控制與修復材料工程技術中心,廣東 廣州 50630)

XH02菌強化反應器脫氮過程中菌群結構的高通量分析

黃鄭鄭1,曹 剛1,2*,李紫惠1,陳海升1,莫測輝1,2(1.暨南大學環境學院,廣東 廣州 510630；2.廣東省污染控制與修復材料工程技術中心,廣東 廣州 510630)

為了強化生物反應器脫氮以及揭示微生物菌群結構隨時間的動態變化,以Ochrobactrum anthropi XH02和SBR反應器為研究對象,利用16Sr DNA高通量測序技術,對不同時期反應器中微生物的菌群結構和多樣性進行了動態分析.研究結果表明,XH02菌的加入使得反應器中TN和COD的去除率分別提升了15%和10%以上;反應器中微生物菌群在屬水平上的相對豐度和多樣性呈先下降后上升的趨勢;XH02的加入對菌群結構產生了較大影響.Acinetobacter、Blvii28和Aquabactenium菌的相對豐度顯著下降,而Fontibacter和Treponema菌的相對豐度則在強化過程中顯著升高;XH02的相對豐度隨著反應器的運行逐漸增加,最后形成了較為穩定的菌群;主成分分析和UPGMA聚類分析大致把反應器運行過程分成4個階段.

異養硝化-好氧反硝化；生物多樣性；高通量測序技術；SBR反應器；菌群結構

微生物在水體氮循環中發揮著重要作用[1].污水中氮素的去除主要通過微生物菌群的硝化和反硝化作用來實現[2].傳統的生物脫氮技術中硝化和反硝化不能同時進行,必須通過兩個獨立的過程來完成.而異養硝化-好氧反硝化脫氮技術實現了在同一個反應器中同時完成硝化和反硝化作用,有效縮短了反應途徑,且脫氮效率更高、反應速率更快.目前,國內外利用異養硝化-好氧反硝化菌強化污水脫氮已取得了較好的效果[3-5],但大部分研究只關注強化過程的脫氮效率以及影響因素,而對反應器中微生物菌群結構的變化研究較少.

分子生物學的快速發展,為研究微生物菌群結構提供了多種方法,包括 RFLP、16S rRNA文庫構建[7]和 PCR-DGGE[8-9]等.但這些傳統方法效率較低,得到的數據信息有限,不能有效、系統地反映群落的豐度和多樣性.而高通量測序技術具有通量高、數據量大、準確率高、測序周期短以及成本低等優點[10],在微生物學研究中具有很強的優越性,廣泛應用于各種分子生物學領域[11-15].

本研究將實驗前期篩出的異養硝化-好氧反硝化菌Ochrobactrum anthropi XH02活化后投加到 SBR反應器中,建立微生物強化系統.利用高通量測序技術分析加入 XH02菌前后反應器中微生物菌群的相對豐度和多樣性隨著運行階段的變化,并對各階段的微生物菌群結構進行了主成分分析和聚類分析.以闡明微生物菌群結構隨著反應器運行的動態演替過程.為后續通過改變環境條件來調控反應器中菌群結構,進而提高反應器處理效率提供依據.以期為污水生物脫氮提供一定的理論和技術參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源 從廣州大坦沙污水處理廠好氧污泥中篩選出一株異養硝化-好氧反硝化菌XH02[16],經過 16S rDNA鑒定,此菌為人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi),GenBank的登錄號為KU999381.

1.1.2 污泥來源 廣州大坦沙污水處理廠A2/O工藝中的好氧活性污泥.

1.1.3 人工合成水質 反應器進水采用人工配水水質,如表1所示.

表1 人工合成水質Table 1 Water quality of the synthetic wastewater

1.2 SBR反應器的建立與運行

SBR反應器由有機玻璃加工而成,有效容積為1.5L,采用向上流進水,利用鼓風曝氣,氣水同向運行.將新鮮的活性污泥接種于 SBR反應器中,周期設定為12h,進水2h,反應9h 25min,沉淀30min,出水5min,期間控制進水流量為 1L/d,空氣從底部經曝氣頭擴散進入反應體系中,用空氣流量計調節進氣量為4.0L/min,溫度控制在30℃左右.加入XH02菌之前,每隔2d測定出水的各個指標,待反應器穩定后加入XH02,每隔3d測定出水水質指標.

1.3 取樣方法和檢測項目

SBR反應器在加入XH02之前的穩定期,取一份污泥樣品保存.XH02加入反應器后,在第2h取樣一次,然后每隔3d取一次污泥樣品,直至21d,共取污泥樣品9份,用于DNA的提取,取污泥樣品的同時,采集出水,并測定COD、TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的濃度變化.

1.4 細菌總DNA的提取

每次取污泥樣品 20mL,加入 50mL錐形瓶中,120r/min搖床震蕩10min使污泥破碎均勻.取10mL于15mL的離心管中,8000r/min離心10min,棄去上清液,收集沉淀,上述步驟重復一次.取5mL新鮮污泥進行總DNA的提取[17],設3個平行,提取的DNA一部分于-20℃保存,另一部分在0.7%的瓊脂糖凝膠中做電泳檢測,并將電泳條帶進行掃描拍照.

1.5 Illumina Miseq高通量測序

首先進行PCR擴增,引物為細菌16Sr DNA引物515F 5′ GTGCCAGCMGCCGCGG 3′;907R 5′ CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 3′,PCR擴增產物用Illumina Miseq平臺雙端測序分析.PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收 PCR產物,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.6 微生物群落結構和多樣性分析

多樣性分析前必須對原始序列去雜,然后進行拼接,通過標簽找回每個樣品對應的序列,低質量的序列被去除.質量控制標準包括:無錯配堿基、精確匹配引物和 barcode、無模糊堿基、長度大于300bp.采用CD-HIT分類法對有效數據在 97%水平上進行OTU劃分,并與 Greengenes數據庫比對,通過RDPclassifier Naive Bayesian分類算法對代表序列在門、綱、目、科和屬5個水平上進行分類注釋.用 Chao指數公式[18]分析樣品的物種豐度,用 Shannon和 Simpson指數公式[19]分析樣品的物種多樣性.并用 Canoco和Mothur軟件分別進行主成分分析和聚類分析.

2 結果與討論

2.1 XH02菌對COD和氮素的去除特性

菌株XH02對COD、TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除特性見圖 1.如圖 1(a)所示,以 NH4+-N為底物的異養硝化過程中,第 60h菌株XH02對COD、TN和NH4+-N的去除率分別為81.10%、62.74%和 95.01%;由圖 1(b)可知,以NO3--N為底物的好氧反硝化過程中,第60h菌株XH02對COD、TN和NO3--N的去除率分別為達到75.73%、70.49%和100%;圖1(c)給出了菌株XH02以NO2--N為底物時的反硝化過程,60h時XH02菌對COD、TN和NO2--N的去除率分別為86.15%、80.40%和97.35%.

圖1 XH02菌對COD、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除特性Fig.1 Removal characteristics on COD, NH4+-N, NO3--N and NO2--N of XH02

2.2 SBR反應器的運行過程

反應器的啟動過程見圖 2(a),在第 1～7d內COD、TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的降解呈現出無規律變化,這一階段為活性污泥的適應期.第7～17d內,COD、TN、NH4+-N、NO3--N和 NO2--N的去除率顯著升高,這一階段污泥中的菌群已逐漸適應環境,一部分不能適應的細菌被淘汰.從 17d開始,反應器基本達到穩定狀態,17～25d內,COD的去除率分別為 78.05%、77.65%、78.05%、77.38%和79.51%,TN的去除率分別為62.54%、62.79%、64.07%、64.78%和62.02%.反應器經過25d的運行,啟動成功.

圖2 反應器的啟動和強化階段各指標去除率的變化Fig.2 Removal changes of indicators in starting and strengthening phase of the reactor

反應器運行穩定后,第25d將XH02菌加入反應器,強化階段開始,COD、TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除率變化見圖2(b).強化階段的前3d內,與未加XH02的反應器相比,COD和 TN的去除率出現了下降的趨勢,可能是因為XH02的加入,與反應器中其他菌群發生強烈的競爭,使整個反應體系內的群落結構發生了變化,一些不適應的菌群被淘汰,適應的菌群繼續生長.在3～15d內,反應器對COD和TN的去除率持續升高,運行至第15d,基本達到穩定狀態.15～21d內COD 的去除率分別為 90.82%、89.58%和90.79%,TN的去除率分別達到78.17%、76.82%和78.49%.

比較反應器的啟動和強化兩個階段,強化反應器在第15d對COD和TN的去除率較原系統分別提高了 15.38%和 13.44%.因此,利用菌劑強化反應器去除氮和有機物是一種有效治理污水的方法.曲洋等[20]的研究中利用菌劑強化反應器,也達到了較好效果,強化系統較原系統對 TN和COD的去除率分別提高了15.24%和5.39%.

2.3 強化反應器中菌群的豐度和多樣性分析

反應器運行各階段的污泥樣品經過高通量測序得到豐度和多樣性指數見圖 3.圖 3(a)中Chao指數的變化趨勢為先降低再升高,Chao指數可以表征微生物菌群的相對豐度,表明反應器中微生物菌群的豐度整體變化趨勢為先降低然后再升高.圖 3(b)和 3(c)中給出了 Shannon和Simpson指數的變化情況,這兩個指數可以表征微生物菌群的多樣性.Shannon指數和 Simpson指數對多樣性的反映情況相似,XH02加入后,0～3d內菌群的多樣性先降低后升高,3～6d內,又迅速降低,6～9d內保持相對穩定的狀態,9～21d內,微生物的多樣性呈現出緩緩上升的趨勢,總體變化趨勢呈先下降后上升.可能是因為 XH02加入反應器后,要適應外界環境,并與其他微生物強烈競爭,爭奪營養環境,不能適應的菌群被淘汰,導致菌群的豐度和多樣性降低.反應器運行后期,菌群的豐度和多樣性又呈現出上升的趨勢,可能是反應器中出現了新的菌屬,也可能是 XH02適應環境后豐度持續升高,體系內形成了新的菌群結構,多樣性升高.邵基倫等[21]的研究利用PCR-DGGE技術分析反應器中微生物菌群豐度和多樣性的變化,也呈現出先下降后上升的趨勢.表明不同運行階段反應器中微生物菌群的豐度和多樣性會發生很大的變化,但微生物菌群可以通過自我調控來適應環境.

圖3 豐度指數與多樣性指數Fig.3 Abundance index and diversity index

2.4 強化過程中微生物菌群結構的變化

2.4.1 16S rDNA序列在門水平上的對比 如圖4所示,9個污泥樣品一共檢測到了23個菌門,共有的菌門為13個,相對豐度前4的菌門分別為Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)和 Planctomycetes(浮霉菌門).其中 Proteobacteria是反應器中最優勢的種群,這與 Snaidr等[22-23]的研究結果類似.XH02加入反應器之前,Proteobacteria的相對豐度為 71.79%,加入目標菌后,Proteobacteria的相對豐度繼續升高,穩定期保持在80%左右,因此XH02對Proteobacteria的生長具有促進作用,可能是因為 XH02 的加入,使得原來和Proteobacteria競爭的菌群,與XH02也形成競爭關系而被削弱,從而Proteobacteria得到更大的生長環境和營養條件,相對豐度持續升高. Proteobacteria為革蘭氏陰性菌,多為兼性或專性厭氧及異養生活,對有機物和氮的去除有重要作用[24].Bacteroidetes在反應器運行初期相對豐度為 18.57%,是反應器中第二大優勢菌群,到運行中期時降至13%左右,然后又上升,運行后期時升至17.60%,表明XH02的加入與Bacteroidetes形成了競爭關系,使得Bacteroidetes生長受阻,相對豐度降低,但 Bacteroidetes的適應和恢復能力較強,運行后期豐度又升高.Bacteroidetes可以降解蛋白質等多種復雜有機大分子化合物,對去除COD具有重要作用[25].Firmicutes在反應器運行開始時的相對豐度為 6.65%,隨著反應器運行,一直降低,后期降至 2.50%,可能是因為 XH02與Firmicutes形成了競爭作用,使得Firmicutes的相對豐度一直降低.Firmicutes屬于革蘭氏陽性菌,和乳酸降解有關,對 COD的去除具有重要作用[26]. Planctomycetes的相對豐度逐漸升高,從運行初期的 0.26%到后期升至 0.63%.它在缺氧環境下可利用亞硝酸鹽氧化銨離子生成氮氣來獲得能量,主要參與脫氮過程[27].

2.4.2 16S rDNA序列在屬水平上的對比 為了進一步闡明反應器運行過程中微生物群落的演替過程,在屬水平上,選取豐度前30的物種作群落結構Heatmap圖,如圖5所示,每一列代表一個樣本,行代表菌屬,色塊代表物種的相對豐度,顏色越紅表示相對豐度越高,顏色越綠表示相對豐度越低.通過色塊對比可以觀察群落結構的變化.Thauera(陶厄氏菌屬)、Thermomonas(熱單胞菌屬)和Flavobacterium (黃桿菌屬)在反應器運行期間占主導地位,它們對氮和有機物的去除都具有重要作用[28-30].其中Thauera、Thermomonas屬于變形菌門(Proteobacteria),Flavobacterium 屬于擬桿菌門(Bacteroidetes).Thauera是反應器中最占優勢的菌屬,反應器運行初期的相對豐度為38.30%,隨著反應器的運行,Thauera的相對豐度上升,中期升高至 50.63%,運行后期又下降至 35.06%. XH02的加入促進了Thauera的生長,后期下降可能是因為反應器中形成了新的菌群結構,產生了新的菌屬,與之競爭.Thermomonas在加入 XH02之前的相對豐度為 4.49%,加入 XH02后, Thermomonas的相對豐度呈現出緩緩下降的趨勢,在運行后期降至 2.37%,可能是因為 XH02與Thermomonas形成了競爭的關系,致使Thermomonas的含量下降.Flavobacterium在反應器運行中相對豐度的變化趨勢為持續下降,從反應器運行初期的4.07%降至運行后期的2.21%.

圖4 門水平上微生物相對豐度的變化Fig.4 Changes in relative abundance of microorganisms at the phylum level

圖 6 顯 示 了 XH02(Ochrobactrum)、Fontibacter、Treponema等菌在反應器運行各階段相對豐度的變化.如圖6(a)所示,XH02在反應器運行初期的相對豐度為 0.02%,隨著反應器運行,XH02的相對豐度持續升高,在反應器運行中期趨于穩定,最高達到0.11%,后期又呈現降低然后再升高的趨勢,但未成為反應器中豐度最高的菌屬,可能是因為投加菌株XH02的量較少,也可能是反應器中一直存在著抑制XH02生長的菌群.

圖5 菌屬的豐度熱圖Fig.5 Heatmap of bacterial community at the genus level

圖6 菌屬的豐度變化Fig.6 Abundance variation at the genus level

由圖 6(b)可知,XH02加入反應器后,使得Fontibacter、Treponema的相對豐度隨著反應器運行逐漸升高.而圖6(c)中Acinetobacter、Blvii28和Aquabactenium的相對豐度隨著反應器運行逐漸降低.因此,XH02加入反應器后,與其他菌群競爭外部環境和營養條件,致使某些菌群的豐度升高或降低,隨著反應器的持續運行,會形成新的菌群結構.

2.5 不同階段的微生物菌群結構分析

2.5.1 微生物菌群的主成分分析 對反應器運行過程中9個污泥樣品的OTU組成進行主成分分析,通過方差分解,將多組數據的差異反映在PCA圖上,樣本間的分散和聚集可以反映菌群結構的相似程度.菌群結構組成越相似,表現在PCA圖中的距離越近,反之則越分散.通過主成分分析可以揭示反應器運行過程中不同階段微生物菌群結構的變化規律[31-32].如圖7所示,可以明顯看出反應器運行 0～3d內各樣品距離較遠,說明運行前期反應器中的微生物種類相似度低,可能是因為 XH02加入后,與反應器中其他菌群發生著強烈的競爭,使得群落結構發生了巨大變化.6～15d內的4個樣品距離較近,表明各樣品中微生物種類相似度較高,反應器在此段時間內微生物群落結構處于相對穩定的狀態,6～15d與18～21d的樣品之間有一定的距離,說明反應器運行后期,微生物群落結構有一定的變化,可能是因為產生了新的菌群.因此,可以將反應器運行過程分成4個不同的階段.表明XH02菌加入反應器后,菌群結構隨著強化的不同時段而改變,更清楚地反映了反應器運行過程中菌群的演替過程.

2.5.2 微生物菌群的聚類分析 微生物菌群變化分析可能由于統計模型的不同而產生差異[33-34],聚類分析能夠較好地反映菌群結構變化與反應器運行的聯系[21].對 9個樣品檢測到的功能基因進行UPGMA聚類分析,結果見圖8,由圖可知,2h的菌群在強化初期,處于不穩定的狀態;3d時反應器內菌群競爭激烈,群落結構較之前不同;6～15d這一階段各菌群相似性高,聚為一類; 18d和21d的菌群相似,較6～15d的菌群不同,聚為一類.因此,強化反應器運行過程分為4個階段,分別為2h、3d、6～15d和18d～21d.表明反應器在不同運行階段,微生物群落存在著一定的演變關系,經過演替最終會形成較穩定的菌群結構.菌群這一變化情況與主成分分析的結果較為一致.

圖7 菌群的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of bacterial community

圖8 菌群的UPGMA聚類分析Fig.8 Cluster analysis of bacterial community by UPGMA

3 結論

3.1 XH02菌強化反應器去除有機物和脫氮有較好的效果,TN和 COD的去除率分別提高了15%和10%以上.

3.2 反應器中微生物菌群在屬水平上的相對豐度和多樣性變化呈先下降后上升的趨勢, Acinetobacter、Blvii28和Aquabactenium菌的相對豐度顯著下降,而Fontibacter和Treponema菌的相對豐度顯著升高,最終形成較穩定的菌群.

3.3 XH02加入反應器后其相對豐度呈逐漸增加的趨勢,后期上下波動,但未成為菌群系統中最優勢的種群.

3.4 主成分分析和UPGMA聚類分析大致把反應器運行過程分為4個階段,分別對應于0～2h、3d、6～15d和18～21d.

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High-throughput sequencing analysis of community structure in reactor enhanced by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacteria XH02.

HUANG Zheng-zheng1, CAO Gang1,2*, LI Zi-hui1, CHEN Hai-sheng1, MO Ce-hui1,2(1.School of Environment, Jinan University, Guangzhou 510630, China；2.Guangdong Engineering Center for Environment Contamination Control and Restorative Materials, Guangzhou 510630, China). China Environmental science, 2017,37(5)：1922～1929

To improve the denitrification of bio-reactor and reveal dynamic changes of microbial community structure over time, the microbial community structure and diversity were analyzed by high-throughput sequencing technology in different stages of the SBR reactor inoculated with heterotrophic nitrification-aerobic denitrification XH02. Results showed that the removal rates of TN and COD increased by more than 15% and 10%, respectively. The relative abundance and diversity of microbial flora on the genus level decreased at first and then increased. XH02 exerted a great influence on the microbial community structure of indigenous microorganisms, leading to a significant decrease in the relative abundance of Acinetobacter, Blvii28 and Aquabactenium, but a visible increase in the relative abundance of Treponema and Fontibacter. The relative abundance of XH02 increased gradually with the operation of the reactor until a relatively stable flora was finally established. The SBR operation was roughly divided into four stages based on the results of principal component analysis (PCA) and UPGMA cluster analysis.

heterotrophic nitrification-aerobic denitrification；biological diversity；high throughput sequencing technology；SBR；microbial community structure

X172

A

1000-6923(2017)05-1922-08

黃鄭鄭(1991-),男,河南洛陽人,暨南大學碩士研究生,主要從事污水生物脫氮的相關研究.

2016-09-22

國家基金委-廣東省政府聯合基金重點項目(U1501233);廣東省基金研究團隊項目(2016A030312009);廣東省環境污染控制與修復材料工程技術研究中心建設項目(2015B090903070)

* 責任作者, 副教授, cao_g@163.com