氯化兩面針堿對人胃癌細胞增殖、遷移的抑制作用

郭桂元 黃子成 林嬋嬋 黃志鵬

(泉州市第一醫院消化內科，福建 泉州 362000)

氯化兩面針堿對人胃癌細胞增殖、遷移的抑制作用

郭桂元 黃子成 林嬋嬋 黃志鵬

(泉州市第一醫院消化內科，福建 泉州 362000)

目的 探討氯化兩面針堿(NC)對人胃癌SGC-7901細胞增殖、遷移的作用及其機制。方法 MTT實驗檢測NC對SGC-7901細胞的增殖作用； Transwell小室實驗檢測NC對SGC-7901細胞遷移和侵襲的影響；Western印跡檢測NC對人胃癌SGC-7901細胞中Bax,Bcl-2,PCNA,MMP2,MMP1和GAPDH表達的影響。結果 MTT實驗表明NC抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，并且呈時間、劑量依賴性(P<0.05)；此外，NC顯著抑制SGC-7901細胞中PCNA表達，呈劑量依賴性(P<0.05)；Transwell小室實驗表明NC顯著抑制SGC7901細胞遷移和侵襲，呈劑量、時間依賴性(P<0.05)；Western印跡表明NC上調凋亡蛋白Bax的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制MMP1以及MMP2的表達(均P<0.05)。結論 NC通過誘導細胞凋亡抑制SGC-7901細胞增殖，通過降解MMP1和MMP2從而抑制SGC-7901細胞侵襲和遷移。

氯化兩面針堿；人胃癌SGC-7901細胞；增殖；侵襲；遷移

胃癌特征就是細胞增殖、遷移以及侵襲不受控制〔1〕。胃癌早期很難診斷，一般確診時已進入晚期〔2〕。兩面針來源于植物兩面針的根，是天然的植物生物堿〔3〕。氯化兩面針堿(NC)是兩面針的氯化物，有抗感染〔4〕、抗瘧〔5〕、抗真菌〔5〕、抗血管生成〔6〕以及抗腫瘤等活性〔7〕。NC抗腫瘤有一定的效果，然而，鮮有文章報道NC對于胃癌增殖、遷移的影響。本文旨在探討NC對于人胃癌細胞SGC7901增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)和噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，RPMI1640和胎牛血清(FBS)購自英國Hyclone 公司。Bax,Bcl-2,PCNA,MMP2,MMP1和GAPDH購自美國Cell Signaling Technology公司。NC購自Tauto Biotech公司，SGC-7901細胞購自中國Cell Resource Center of Life Sciences，培養在包含有10%FBS和100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素。在5%CO2和37℃培養箱中培養。細胞傳代時用0.25%的胰酶處理。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗 細胞增殖實驗用MTT實驗測定。SGC-7901細胞培養在96孔板中，接種密度為1×104，接種24 h，并且設置5個復孔。之后分兩組處理。第一組用不同濃度NC處理細胞48 h。將NC溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，濃度分別為0、20、40、80 μmol/L。另外一組用40 μmol/L NC處理SGC-7901細胞24、48、72 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞之后，用20 μl的5 mg/ml MTT在37℃處理細胞4 h。棄掉MTT之后，每孔加入100 μl DMSO溶液。96孔板在室溫下溫和搖蕩10 min。用酶聯免疫檢測儀在490 nm處檢測吸光值。

1.2.2 Transwell小室實驗 將基質膠溶液(培養基∶基質膠=7∶1)鋪滿Transwell小室底部，將Transwell小室放在細胞培養箱(5%CO2，37℃)中培養過夜，使底部的基質膠溶液凝固；將不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)或者不同時間(24、48、72 h)NC處理SGC-7901細胞培養直至細胞密度為1×106個/ml。用胰酶消化細胞，重懸的細胞培養在無血清培養基，細胞液加入上室，下室加入500 μl含有10%FBS培養基。培養24 h。之后用棉簽擦拭基質膠以及上室的細胞。用95%乙醇處理小室10 min，晾干之后加入4 g/L結晶紫200 μl染色10 min。清水洗滌。取4個視野，記錄通過半膜的細胞數，取平均值。

1.2.3 Western印跡實驗 不同處理的細胞用PBS洗滌2次，然后用裂解液在冰上裂解30 min。然后用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測細胞裂解液的濃度。將50 μg蛋白上樣于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中，然后電轉到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上。然后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗5 min，3次，然后孵育相應的一抗，并且4℃過夜；之后TBST洗滌5 min，3次；然后孵育二抗2 h；之后用化學發光液均勻撒在膜上，顯影。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗，采用Image J軟件對條帶的灰度值進行定量分析，統計圖采用GraphPad Prism5軟件分析。

2 結 果

2.1 NC抑制SGC-7901細胞的增殖 見圖1。0、20、40、80 μmol/L NC組細胞存活率分別為(91.2±2.56)%、(74.6±5.23)%、(52.6±3.14)%、(45.3±2.46)%，表明NC顯著抑制SGC-7901細胞增殖，并且具有劑量依賴關系(P<0.05)。NC抑制SGC-7901細胞增殖還呈現時間依賴關系24、48、72 h細胞存活率分別為(72.3±3.26)%，(53.6±3.14)%,(38.1±2.07)%(P<0.05)。此外，Western印跡結果表明NC顯著抑制SGC-7901細胞中PCNA表達，呈劑量依賴性0、20、40、80 μmol/L NC組PCNA相對表達量分別為(0.26±0.013)、(0.22±0.015)、(0.14±0.010)、(0.09±0.019)(P<0.05)。

2.2 Transwell chamber法檢測NC對SGC-7901細胞遷移、侵襲的影響 采用濃度分別為20、40、80 μmol/L的NC處理SGC-7901細胞，穿過膜的數量〔(62.4±1.58)個、(49.2±1.21)個、(40.2±1.77)個〕少于對照組〔(86.2±3.67)個〕，并且呈劑量依賴性(P<0.05)。40 μmol/L NC處理SGC-7901細胞24、48、72 h后，Transwell實驗結果顯示SGC-7901細胞穿膜數量減少〔(64.6±2.13)個、(48.4±1.65)個、(32.6±1.73)個〕，呈時間依賴性(P<0.05)。見圖2。

2.3 Western印跡 NC可以抑制SGC-7901細胞增殖，可能是通過誘導細胞凋亡實現的。NC可以抑制SGC-7901細胞侵襲、遷移，而降解細胞外基質(ECM)是細胞侵襲、遷移的關鍵，MMP1和MMP2是ECM降解酶〔13〕，可以降解基質或者非基質蛋白。不同濃度NC(0、20、40、80 μmol/L)處理SGC-7901細胞后，Bax蛋白表達上調〔(0.15±0.01)，(0.25±0.01)，(0.41±0.01)，(0.50±0.02)〕，Bcl-2蛋白表達減少〔(0.63±0.02),(0.48±0.02),(0.40±0.01),(0.31±0.01)〕，呈劑量依賴性(P<0.05)。MMP1〔(0.72±0.02,(0.58±0.01),(0.51±0.01),(0.43±0.01)〕和MMP2蛋白〔(0.73±0.05),(0.60±0.02),(0.48±0.02),(0.32±0.01)〕表達降低，呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖3。

圖2 Transwell侵襲實驗分析NC對SGC-7901細胞遷移、侵襲的影響

圖3 在SGC-7901細胞中，用Western印跡檢測不同濃度NC對Bax、Bcl-2、MMP1和MMP2表達影響

3 討 論

胃癌的進展從原發部位到繼發部位，從而導致在多級過程中遷移、侵襲。首先從原發部位分離之后遷移到ECM，然后滲入血管或者淋巴管，緊接著腫瘤細胞在脈管系統中存活進而形成繼發性腫瘤〔8〕。從植物中提取的化學物質包括萜類、黃酮類、異硫氰酸酯類以及生物堿類都是從中藥植物中提取〔9〕。NC通過ERK相關的信號通路誘導腎癌細胞的凋亡，并且伴隨著Bax上調以及Bcl-2的下調〔10〕。NC通過c-scr-fak信號通路抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移〔11〕。本文發現NC抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖、侵襲和遷移，其抑制作用呈劑量、時間依賴性。已有報道表明NC可以誘導腫瘤細胞凋亡〔10〕，推測NC抑制SGC-7901細胞增殖是通過誘導其凋亡。Bcl-2家族蛋白包括Bcl-2，Bcl-XL，Bad和Bax是凋亡通路關鍵的調節因子〔12〕。

本文進一步通過Transwell侵襲實驗證實NC可以抑制SGC-7901細胞侵襲。MMPs是一種Zn2+依賴的內源性蛋白酶，能夠降解ECM從而促進細胞侵襲和遷移。Western印跡實驗結果表明NC抑制MMP1和MMP2表達，呈劑量依賴性。

綜上所述，NC通過誘導細胞凋亡抑制SGC-7901細胞增殖，通過降解MMP1和MMP2從而抑制SGC-7901細胞侵襲和遷移。NC可能成為治療胃癌的新型藥物。

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6 程翔宇.氯化兩面針堿對前列腺癌細胞抑制增殖、侵襲與誘發凋亡的研究〔D〕.濟南：山東大學,2015.

7 王 勇，楊永濱，馬玉琛.MMP1,MMP2和TIMP2在雄附方干預大鼠肺間質纖維化中的作用〔J〕.解放軍醫學院學報,2013；34(4):376-8.

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11 Pan X,Han H,Wang L,etal.Nitidine chloride inhibits breast cancer cells migration and invasion by suppressing c-Src/FAK associated signaling pathway〔J〕.Cancer Lett,2011;313(2):181-91.

12 Lohmann CM,League AA,Clark WS,etal.Bcl-2:bax and bcl-2:Bcl-x ratios by image cytometric quantitation of immunohistochemical expression in ovarian carcinoma:correlation with prognosis〔J〕.Cytometry,2000;42(1):61-6.

〔2016-11-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

郭桂元(1974-)，男，副主任醫師，主要從事消化系統腫瘤研究。

R28

A

1005-9202(2017)09-2137-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.023