劉秀蓮 王潔黃慈丹 林文 楊春

海口地區新生兒G6PD基因突變分析

劉秀蓮 王潔★黃慈丹 林文 楊春

目的 了解海口地區新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥的發生率及基因突變特點。 方法 用熒光斑點法對2016年1月1日至2016年2月24日出生于海口的5 295例新生兒進行G6PD活性篩查，對173例初篩陽性的標本用多色探針熒光PCR熔解曲線法（MMCA）進行基因分型。結果 本次篩查發現海口地區新生兒群體的G6PD缺乏癥發生率為3.87%（205/5 295），其中男女發生率分別為4.99%（142/2 848）和2.57%（63/2 447）。173例初篩陽性標本中檢出142例（82.08%）有基因突變，基因攜帶率為3.18%（142/5 295/84.39%）。共檢出6種基因突變類型，含74例（52.11%）c.1376 G＞T，33例（23.24%）c.1388 G＞A，13例（9.15%）c.95 A＞G，8例（5.63%）c.1024 C＞T，4例（2.82%）c.871 G＞A，5例（3.52%）c.392 G＞T，并檢出3例（2.11%）c.1376 G＞T復合c.1388 G＞A突變、1例（0.71%）c.392 G＞T復合c.517 T＞C突變、1例（0.71%）c.95 A＞G復合c.1388 G＞A突變。 結論 海口地區是G6PD缺乏癥高發地區，c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95 A＞G是主要的3種基因突變型。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥；基因突變；多色探針熒光PCR熔解曲線法

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥，又稱蠶豆病，是一種X連鎖不完全顯性遺傳性溶血性酶缺陷疾病，臨床表現差異大，從無癥狀到新生兒黃疸、藥物或感染引起的急性溶血、蠶豆病和慢性非球形細胞溶血性貧血，嚴重者導致新生兒期核黃疸，引起死亡或永久性神經系統的損傷。該病在我國呈“南高北低”的分布特點，以廣東、廣西及海南發病率最高［1］。據統計2007至2010年海南省新生兒G6PD缺乏癥發生率為3.17%［2］。海口市地處海南省北部，總人口222.3萬，以漢族人群為主。本文采用多色探針熒光PCR熔解曲線法（multicolor melting curve analysis，MMCA）對新生兒濾紙干血片進行基因檢測，以探討海口地區G6PD基因突變類型及其分布特點。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2016年1月1日至2016年2月24日出生于海口市內各家醫院的5 295例新生兒，男性2 848例，女性2 447例，男女比例為1.16∶1。出生3 d后采集足跟血，制成濾紙干血斑標本。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器

實驗中用到的儀器設備有：賽默飛世爾微孔板孵育振蕩器THERMO-IEMS 1415、芬蘭1 420時間分辨免疫分析儀、廈門致善核酸提取儀Lab-AidTM824及上海宏石全自動醫用PCR分析系統SLAN-96S。

1.2.2 試劑

紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）活性篩查試劑盒（純化學反應熒光法）來源于廣州市米基醫療器械有限公司，試劑批號Y150810-08。

Lab-Aid核酸提取Micro試劑盒（試劑批號160607）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測試劑盒-熒光PCR熔解曲線法（試劑批號16070102）均來源于廈門致善生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 G6PD熒光斑點定性試驗

采用紅細胞G6PD活性篩查試劑盒進行G6PD活性篩查，步驟如下：（1）用打孔器在濾紙干血斑標本上打下1個直徑3 mm的小血片置于空白微量板中；加入熒光反應試劑120 μL/孔，于Thermo iEMS微孔板孵育振蕩器中37℃恒溫900 r/min振幅振動30 min后，去紙片再振蕩1 min，用芬蘭1420時間分辨免疫分析儀讀取熒光數值。結果判讀：熒光數值＞1 600為活性正常，熒光數值≤1 600為活性缺乏。

1.3.2 G6PD突變基因檢測

收集G6PD活性缺乏的濾紙干血斑，打下2個直徑3 mm的小血片，用核酸提取儀Lab-Aid824提取基因組DNA。然后采用帶有FAM、HEX、ROX 和Cy5檢測通道且具有熔解曲線分析功能的PCR 儀SLAN-96，同時進行基因擴增和熔解曲線分析，結果參照試劑盒說明書進行基因型判讀：通過比較待檢樣本與野生型對照的熔解峰之間熔點（Tm值）的差異判斷樣本是否發生突變及突變的類型。該G6PD基因突變檢測試劑盒可檢測中國人常見的16種G6PD基因突變類型：c.95A＞G、c.383T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.1381G＞A、c.1387C＞T、c.493A＞G、c.519C＞T。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計數資料用百分率表示。

2 結果

2.1 海口地區新生兒G6PD缺乏癥發生率

在5 295例（男2 848例，女2 447例）新生兒中，檢出G6PD活性缺乏205例（男142例，女63例），總發生率3.87%（205/5 295）；其中，男女發生率分別為4.99%（142/2 848）和2.57%（63/2 447）。男性發生率明顯高于女性，符合X連鎖不完全顯性遺傳規律。

2.2 G6PD缺乏癥患者基因突變分析

在G6PD活性缺乏的205例樣本中，剔除血斑質量差和血斑不足的樣本，還有173例（男126例，女47例）進行基因突變檢測，基因檢測受檢率為84.39%（173/205）。經MMCA檢測，在173例受檢樣本中檢出142例有G6PD基因突變，其中男105例，女37例，基因突變率82.08%，見表1。據此推算海口地區新生兒群體的G6PD基因攜帶率為3.18% （142/5 295/84.39%）。

2.3 G6PD基因突變類型和分布特點

142例新生兒G6PD缺乏癥患者中共檢出6種G6PD 基 因 突 變 型 ：c.1024C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.392G＞T、c.871G＞A、c.95A＞G和3種復合突變，各基因突變類型和分布情況見表2。

表1 海口地區新生兒G6PD缺乏癥基因突變率Table 1 Genotypic mutation rate of G6PD deficiency in neonates of Haikou area

表2 142例新生兒G6PD缺乏癥患者基因突變類型結果Table 2 Genotype mutant results of 142 neonates with G6PD deficiency

3 討論

G6PD缺乏癥在我國呈“南高北低”的分布特點，以廣東、廣西及海南發病率最高。據北京國家臨床實驗中心2013年196個實驗室上報的30 000萬新生兒篩查結果顯示，G6PD的發生率為1∶44［3］。本研究結果顯示，海口地區新生兒G6PD缺乏癥的發生率為3.87%，接近于海南省的發生率3.17%［2］，但低于澄邁縣人群的發生率5.54%［4］，說明G6PD缺乏癥的發生率具有一定的地域或群體特異性。

G6PD缺乏癥主要是由于基因突變引起的，因編碼區內堿基突變導致酶活性改變，形成血管內溶血，臨床上常表現為新生兒黃疸、蠶豆病、藥物性溶血、感染性溶血等。該病也是新生兒高膽紅素血癥的重要病因［5］。迄今，全球已發現近200種G6PD基因突變［6］，我國已發現的突變類型則超過30種［7-8］。G6PD缺乏癥目前尚無有效的根治方法，所以及早篩查與確診以及采取積極有效的預防措施、控制誘因，是減少G6PD缺乏癥發生最有效的措施。

多色探針熒光PCR熔解曲線法（MMCA）是檢測中國人常見的16種G6PD基因突變類型的新方法。該法不易造成交叉污染，具有操作簡便、高通量和結果易判讀的優點［9］。本研究在173例G6PD活性缺乏樣本中檢出6種基因突變：c.1376G＞T （52.11%）、c.1388G＞A（23.24%）、c.95A＞G（9.15%）、c.1024 C＞T（5.63%）、c.392 G＞T（3.52%）和c.871 G＞A（2.82%），這和陳開科等［4］在72例G6PD缺乏的澄邁人群樣本中檢出的6種G6PD基因點突變類型是一致的，但各種突變類型所占的比例有所不同，說明不同地區人群的G6PD基因突變譜不同。中國人最常見的3種G6PD基因類型［10］，即c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95A＞G，在本組樣本中檢出的比例共占84.5%，表明c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95A＞G是海口地區新生兒主要的基因突變型，這和以往的報道相符合［7，11-12］。同時本研究還檢測到3例c.1376 G＞T復合c.1388 G＞A、1例c.392 G＞T復合c.517 T＞C、1例c.95 A＞G復合c.1388 G＞A，這5例復合突變都發生于G6PD活性缺乏的女性，提示復合突變很可能是雙雜合子，而不是單倍型，有待進一步追查其雙親的基因型以確定。這些復合突變會引起怎樣的臨床結果，也有待后續的追蹤觀察。本研究未檢測到c.383T＞C、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.1004C＞A、c.1360C＞T、c.1381G＞A、c.1387C＞T、c.493A＞G和c.519C＞T等突變，可能與基因檢測的標本量較小有關。

本研究173例G6PD活性缺乏者中，有31例未檢測到基因突變，分析原因可能是：（1）含有16個突變位點以外的基因突變類型，有待下一步通過基因測序法進行檢測確認；（2）某些疾病或者藥物的影響，降低了G6PD酶活性；（3）31例樣本中有29例是由海口市內其他醫院采集后，一周內遞送至筆者所在醫院，標本采集不規范、運送時間長或處理不當等因素均會使G6PD失活，導致其活性降低。

海口地區是G6PD缺乏癥的高發區，新生兒G6PD缺乏癥發生率為 3.87%，基因突變以c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95 A＞G基因型為主，利用濾紙干血斑標本在新生兒群體中開展G6PD缺乏癥的表型篩查和基因型檢測，對高危人群給予干預指導和建議能有效減少溶血性貧血的發生，避免給患者家庭造成更大的經濟與精神負擔。

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Genotyping analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in neonates of Haikou area

LIU Xiulian，WANG Jie★，HUANG Cidan，LIN Wen，YANG Chun
（Center of Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Care Hospital of Hainan Province，Haikou，China，570206）

Objective To investigate the prevalence and genotypic mutant characteristics of the glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)deficiency in neonates of Haikou area. Methods A total of 5 295 neonates born in the Hospital of Haikou area were screened for G6PD deficiency by inflorescent spot test(FST) from January 1,2016 to February 24,2016.Then,173 positive screening samples were subjected to genotyping through multicolor melting curve analysis(MMCA). Results The prevalence of G6PD deficiency in Haikou was 3.87%(205/5 295),of the 205 infants suspected to be G6PD deficiency based on FST,142(4.99%,142/2 848) were males and 63(2.57%,63/2 447)were females.Among these 173 positive screening samples based on FST, 142 had a gene mutation;6 kinds of mutation were found including 74 cases of c.1376 G＞T(52.11%),33 cases of c.1388 G＞A(23.24%),13 cases of c.95 A＞G(9.15%),8 cases of c.1024 C＞T(5.63%),4 cases of c.871 G＞A (2.82%),5 cases of c.392 G＞T(3.52%);and 3 cases with both c.1376 G＞T and c.1388 G＞A(2.11%),1 case with both c.392 G＞T and c.517 T＞C(0.71%),1 case with both c.95 A＞G and c.1388 G＞A(0.71%). Conclusion The incidence of G6PD deficiency is high in Haikou area.The three G6PD mutations at 1376,1388 and 95 are the most common variants in this area.

Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency;Genotypic mutation;Multicolor melting curve ana

海南省自然科學基金面上項目（20168327）

海南省婦幼保健院檢驗中心，海南，海口570206

★通訊作者：王潔，E-mail:wj59726@sina.com