參附注射液對家兔心肺復蘇后心肌細胞凋亡基因caspase—3的影響

蘇天生　羅繼紅　盧靜

[摘要] 目的 探討參附注射液（SF）對家兔缺氧型心跳驟停-心肺復蘇（CA-CPR）模型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的影響。 方法 普通家兔18只，采用隨機數字表法隨機分為SF組、對照組和生理鹽水（NS）組，每組6只。除對照組外，制作缺氧型CA-CPR模型。SF組給予參附注射液2.1 mL/kg（生理鹽水稀釋至5 mL），對照組、NS組予生理鹽水5 mL，分別在復蘇后分3次每隔10 min緩慢注射。三組用藥后采用RT-PCR法檢測caspase-3 mRNA表達。 結果 與對照組比較，SF組和NS組caspase-3 mRNA表達增加（P<0.01）；與NS組比較，SF組caspase-3 mRNA表達減少（P<0.01）。 結論 SF對CPR后心肌細胞凋亡基因caspase-3活性有抑制作用。

[關鍵詞] 參附注射液；心跳驟停；心肺復蘇；心肌細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）36-0018-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of Shenfu injection（SF） on caspase-3 in hypoxic cardioplegia-cardiopulmonary resuscitation （CA-CPR） in rabbits. Methods A total of 18 normal rabbits were randomly divided into SF group， control group and NS group by random number table method， 6 rabbits in each group. The hypoxic CA-CPR model was made except the control group. SF group was given 2.1 mL/kg of Shenfu injection（diluted by 5 mL of saline）， control group， NS group were treated by 5 mL saline， respectively， after recovery in three times every 10 min slow injection. The expression of caspase-3 mRNA in the three groups was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）. Results The expression of caspase-3 mRNA in SF group and NS group was increased compared with the control group（P<0.01）. The expression of caspase-3 mRNA in SF group was decreased compared with NS group（P<0.01）. Conclusion SF has inhibitory effect on the activity of cardiomyocyte apoptosis gene caspase-3 after CPR.

[Key words] Shenfu injection； Cardiac arrest； Cardiopulmonary resuscitation； Cardiomyocyte apoptosis； Caspase-3

心跳驟停（cardiac arrest，CA）是常見急危重癥，心肺復蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）過程中心肌缺血再灌注（I/R）后會引起心功能損傷，其中心肌細胞凋亡起著重要作用。心肌缺血再灌注時對心肌細胞的損傷較為嚴重，不僅能夠導致大量心肌細胞凋亡，同時也會由于缺血缺氧狀態導致心肌損傷，造成心功能損傷，甚至很可能會再次發生心肌梗死或者心跳驟停，對心肺復蘇患者的心臟功能和生命質量均造成嚴重的影響。現代研究表明，參附注射液（SF）對心肌缺血再灌注有重要的保護作用[1-4]。但是關于SF對心跳驟停心肺復蘇患者心功能保護的作用機制研究尚未完全明確，尤其是保護作用機制仍待進一步研究證實。鑒于此，本研究通過研究SF對CPR后家兔心肌細胞凋亡基因caspase-3的影響，為SF在心肺復蘇中的臨床應用提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

動物：普通級家兔18只，體重約2～3 kg，雌雄不拘，由福建中醫藥大學動物中心提供[動物合格證號：（閩檢證字）第2013A001號]。器材：美國惠普公司心電監護儀；有創動脈血壓壓力轉換器；手提呼吸機。藥品：參附注射液[雅安三九藥業有限公司，批號：050809，每毫升含0.5 mg人參皂甙（C54H92O23），0.1 mg烏頭堿（C34H47NO11）]。試劑：caspase-3抗體（兔多克隆抗體，武漢博士德）。

1.2 模型制作、標本采集與檢測

將家兔隨機分為SF組、對照組、NS組，每組6只。除對照組外，制作缺氧型CA-CPR模型[5]，經耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（3%）麻醉，行頸總動脈置管術以監測平均動脈壓，再行氣管切開置管術以夾閉氣管窒息復制缺氧CA-CPR模型；實驗全程心電監護。SF組于復蘇成功后，分3次注射，每隔10 min以2.1 mL/kg濃度的參附注射液用NS稀釋至5 mL經頸外靜脈緩慢注射；對照組、NS組用NS 5 mL頸外靜脈注射；以心跳恢復4 h計算存活率，實驗結束后，取新鮮的心肌組織50 mg機械破碎，待用。

將待檢樣品中加入濃度為0.25%胰蛋白酶進行消化，溫度為37℃，將細胞收集后均勻吸出上層，反復操作5～6次。將混懸液進行離心處理，時間為10 min，轉速為2000 r/min。采用DMEM洗滌后再次將混懸液進行離心處理，時間為10 min，轉速同上。將上清液撇去后向其中加入濃度為20%的胎牛血清，并且在培養基中制作細胞懸液。在培養瓶中充入95%的空氣以及5%的二氧化碳，將經過上述步驟處理的細胞孵育，時間為90 min。完成該項操作后將含有心肌細胞的培養液進行轉移處理，在另一個培養瓶中繼續進行培養，前72 h內需要向其中加入濃度為0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶，能夠抑制非心肌細胞的增殖和分化。

根據caspase-3試劑盒操作，計算得到各組caspase-3 mRNA的相對含量。方法為RT-PCR（實時PCR擴增試驗），操作如下：首先提取總RNA，將抽提的總RNA按照模板進行合成。引物設計由深圳晶美生物工程有限公司完成并合成，然后配置20 μL PCR反應液，在95℃條件下熱啟動5 min，然后在95℃條件下水浴20 s，58℃條件下水浴20 s，72℃條件下水浴20 s，共進行40個循環后將擴增的目的基因與對照基因完成對比。利用Ct值對caspase-3 mRNA的表達進行定量。同組中每個樣本目的基因測得的Ct值與對照基因中的Ct值之間的差異記為△Ct值，然后將處理組的△Ct值與對照組的△Ct值相減，得出△△Ct值，將其代入計算式2-△△Ct中即刻求出對照組PCR濃度條件下的對照值，將其用以表示caspase-3 mRNA的相對表達量。在該實驗過程中內參為β-actin，可以借此完成定量檢測和分析。

1.3 統計學處理

采用 SPSS17.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗，以P<0.01為差異有高度統計學意義。

2 結果

SF組心跳恢復維持至4 h，4 h存活率100%，NS組復蘇失敗1只，4 h成功率83.33%。各組家兔心肌caspase-3 mRNA表達的變化見表1。三組caspase-3 mRNA相對表達量比較差異有顯著性（P<0.01），與對照組比較，SF組、NS組caspase-3 mRNA表達增加，差異有統計學意義（P<0.01）。與NS組比較，SF組caspase-3 mRNA表達減少，差異有高度統計學意義（P<0.01）。

3 討論

心肺復蘇后心肌缺血再灌注損傷病因復雜，大量研究表明心肌細胞凋亡是其中一個重要原因。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成員，是參與凋亡的關鍵因子，激活后可引起細胞凋亡，降低其活性可抑制細胞凋亡[6-7]。caspase-3是細胞凋亡的主要因子，是關鍵性蛋白酶切，使之激活或滅活，其水解底物分別參與DNA修復、mRNA降解和細胞骨架的重建等[8-9]。Condorelli G等[10]發現在心肌缺血-再灌注模型中，caspase-3轉基因大鼠的心肌梗死面積較大，更易因心力衰竭死亡。

本研究應用的參附注射液[11]是據明代薛己著作《正體類要》中的參附湯制成的中藥靜脈注射劑，由人參、附子兩味中藥的提取物混合而成，參附注射液對循環系統有顯著的作用，有較好的升壓、擴張血管、改善微循環、防治全身多器官缺血再灌注損傷的作用。目前參附注射液已廣泛應用于臨床急危重癥搶救，其對心肺復蘇后多器官的保護作用越來越受到重視。已有研究表明，參附注射液對心肺復蘇模型大鼠的心臟功能具有較好的改善作用，并可減輕其機體氧化應激狀態和心肌損傷，抑制心肌細胞凋亡[12]。本實驗通過建立心肺復蘇家兔模型，觀察復蘇成功后心肌細胞凋亡的發生情況，并以參附注射液干預治療，探討益氣回陽救逆法對心肺復蘇后心肌細胞保護的作用機制，為臨床診治提供實驗依據。

在心肌梗死再灌注損傷患者中應用參附注射液輔助治療較單純常規西藥治療比較，不僅能夠有效改善心臟功能和生活質量，對促進快速康復也有積極且重要的意義[13-14]。研究顯示[15]，參附注射液對實驗大鼠心肌損傷再灌注過程中心肌細胞的保護作用顯著，能夠有效減少心肌細胞凋亡，進而起到良好的保護實驗動物心功能的目的，推測SF注射液可能對心肌梗死再灌注損傷患者的心功能有良好的保護作用，并且與改善心肌細胞凋亡狀態有密切的關系。本研究結果中，對照組、SF組和NS組caspase-3 mRNA相對表達量組間差異有顯著性，其中SF組、NS組caspase-3 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，表明心跳驟停后心肺復蘇會促進家兔心肌細胞凋亡基因caspase-3 mRNA表達，但SF組caspase-3 mRNA相對表達量遠遠低于NS組，說明SF注射液能夠通過抑制caspase-3 mRNA的表達，進而降低caspase-3蛋白的表達水平，從而達到理想的抑制細胞凋亡狀態的目的，實現良好的心功能保護作用。由此可知，參附注射液對心肺復蘇患者心功能的保護作用很有可能與抑制caspase-3 mRNA表達、降低caspase-3蛋白有關。本研究結果與既往相關研究結論一致[16]，共同證實了參附注射液對心肺復蘇患者心肌梗死再灌注損傷過程中心功能的保護作用。

綜上所述，本研究結果表明參附注射液具有抑制促凋亡基因caspase-3活性的作用，其可能是參附注射液抑制CPR期間家兔心肌細胞凋亡作用機制之一。本研究還不夠深入，有待進一步研究。

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（收稿日期：2016-09-18）