大鼠低氧性肺血管重塑時硫化氫對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白在肺血管壁異常堆積的調節作用

金微瑛　童夏生　阮正英

[摘要] 目的 探討大鼠低氧性肺血管重塑時硫化氫對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白在肺血管壁異常堆積的調節作用。 方法 購買首都醫科大學實驗動物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠，依據隨機數字表法將大鼠分為低氧組（n=14）、低氧+硫氫化鈉（NaHS）組（n=12）、對照組（n=12），建立大鼠HPH模型，監測其血流動力學，測定其血漿H2S含量，檢測其肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，最后進行結果判定與半定量分析、統計學分析。 結果 低氧組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05），血漿H2S含量顯著低于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05），肺小型肌性動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05）；低氧組、低氧+NaHS組、對照組大鼠肺中型肌性動脈Ⅰ型膠原蛋白表達逐漸降低（P<0.05），低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動脈Ⅲ型膠原蛋白表達均顯著高于對照組（P<0.05）。低氧組大鼠肺小型肌性動脈、肺中型肌性動脈Ⅰ型膠原mRNA表達均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05）；低氧組、對照組、低氧+NaHS組大鼠肺小型肌性動脈、肺中型肌性動脈Ⅲ型膠原mRNA表達均逐漸降低（P<0.05）。 結論 大鼠低氧性肺血管重塑時硫化氫能夠有效抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表達，進而可能對低氧性肺血管重塑進行有效緩解，值得臨床充分重視。

[關鍵詞] 大鼠低氧性肺血管重塑；硫化氫；Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白；肺血管壁異常堆積；調節作用

[中圖分類號] R543.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）36-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the regulatory effects of hydrogen sulfide on abnormal accumulation of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary vascular wall of rats with hypoxic pulmonary vascular remodeling. Methods A total of 38 cases of healthy male Wistar rats purchased from the experimental animal center of Capital Medical University， these rats were divided into hypoxia group （n=14）， hypoxia+sodium hydrosulfide （NaHS） group （n=12） and control group （n=12） according to the random number table method， rat model of HPH was established， hemodynamics was monitored， contents of H2S in plasma were determined， typeⅠand Ⅲ collagen in the lung tissues were detected， finally the results were determined and semi quantitative analyzed and statistically analyzed. Results The mPAP level， RV/（LV+SP） of the hypoxia group were significantly higher（P<0.05）， the content of plasma H2S was significantly lower （P<0.05）， the expression of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary small muscular arteries were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅰ collagen in lung and muscular artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group， control group decreased gradually（P<0.05）， the expressions of type Ⅲ collagen in pulmonary muscular medium artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group were significantly higher than the control group （P<0.05）. The expressions of type Ⅰ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular artery of the hypoxia group were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅲ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular arteries of the hypoxia group， hypoxia group+NaHS group， control group were gradually decreased （P<0.05）. Conclusion Hydrogen sulfide can effectively inhibit the expressions of typeⅠand Ⅲ collagen and mRNA in pulmonary vascular wall， and it may be able to alleviate the pulmonary vascular remodeling of rats， so is worthy of the clinical full attention.

[Key words] Hypoxic pulmonary vascular remodeling of rats； Hydrogen sulfide； Collagen typeⅠand Ⅲ； Abnormal accumulation of pulmonary vascular wall； Regulation

低氧性肺動脈高壓（HPH）的病理基礎主要為肺血管重塑，而在低氧性肺血管重塑中，膠原重塑占有極為重要的地位，該領域的重要課題就是研究其調節機制[1]。以往臨床普遍認為[2]硫化氫（H2S）屬于毒性廢氣，最近臨床發現[3]，心血管系統會內源性生成H2S，同時其具有重要的病理生理學效應，在調節心肺血管功能的過程中，H2S屬于新型氣體信號分子，能夠在極大程度上緩解低氧誘導的肺血管重塑及肺動脈高壓。本研究探討了大鼠低氧性肺血管重塑時硫化氫對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白在肺血管壁異常堆積的調節作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2016年1～6月購買首都醫科大學實驗動物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠（批準號：091017），體重200～1800 g，平均（190±10）g，依據隨機數字表法將大鼠分為低氧組（n=14）、低氧+硫氫化鈉（NaHS）組（n=12）、對照組（n=12）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HPH模型 低氧艙有縫隙相通于外界大氣，能夠為艙內氣體以較慢的速度進出提供良好的前提條件，從而始終保持艙內氣壓和大氣壓的平衡。在進行低氧處理的過程中在低氧艙內放置大鼠，將氮氣通入艙內，將艙內的部分氧氣替換掉，從而有效降低艙內氧氣濃度。用小風扇不斷混勻艙內混合氣體，采用上海雷磁公司生產的RSS-5100型氧濃度監測儀對艙內氧濃度進行隨時監測，對向艙內注入的氮氣流量進行控制，途徑為對減壓閥及氣體流量表進行調節，保持艙內氧濃度為（10.0±0.5）%。在常壓低氧艙內放置低氧組、低氧+NaHS組大鼠，艙內O2、N2分別占10%、90%，每天10：00～16：00連續低氧6 h，每天1次，共持續3周。低氧前給予低氧+NaHS組大鼠腹腔注射新鮮配置的14 μmol/kg H2S供體NaHS溶液，每天1次，給予低氧組、對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。三組大鼠具有相同的飲食飲水條件。達到低氧性肺動脈高壓大鼠診斷標準，提示造模成功。

1.2.2 血流動力學監測 完成低氧后給予大鼠腹腔注射1.2 g/kg體重烏拉坦麻醉，肺動脈、頸動脈插管分別對肺動脈平均壓（mPAP）、體循環平均壓（mAP）進行測定。將胸腔打開，取出心臟，分別對右心室（RV）、右心室（LV）+右間隔（SP）進行稱量，然后計算RV/（LV+SP）。

1.2.3 血漿H2S含量測定 將0.5 mL 1%醋酸鋅加入試管中，然后將0.1 mL血漿標本加入其中，混勻后將0.5 mL 30 mmol/L三氯化鐵+0.5 mL 20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽加入其中，在室溫下進行20 min的孵育，之后將1 mL 10%三氯醋酸沉淀蛋白加入其中，將2.5 mL蒸餾水加入其中將體積補足至5 mL，離心 5 min，將上清液吸出來，在670 nm處對上清液的吸光度（A）值進行檢測，然后計算上清液中H2S含量，在此過程中運用亞甲藍分光光度法，嚴格依據標準曲線。

1.2.4 肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白檢測 采用天津TBD公司生產的Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化試劑盒對肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白進行檢測，采用武漢博士德公司生產的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA原位雜交試劑盒對Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA原位雜交進行檢測。

1.3 結果判定與半定量分析方法

陽性信號的標準為光學顯微鏡下棕黃色顆粒[4]。運用半定量積分方法分析肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型膠原表達強度，隨機檢測每張切片中的10條肺小型、中型肌性動脈，外徑分別在50 μm以下、50～150 μm之間[5]。

1.4 統計學分析

采用統計學分析軟件SPSS10.0分析數據，計量資料用（x±s）表示，多組均數比較用單因素方差分析（ANOVA），用Bonferroni進一步進行組間比較，檢驗標準α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠的血流動力學指標比較

低氧組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05），但低氧+NaHS組、對照組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）之間的差異均不顯著（P>0.05），三組大鼠的mAP之間的差異均不顯著（P>0.05），見表1。

2.2 三組大鼠的血漿H2S含量比較

低氧組大鼠的血漿H2S含量[（192±22）μmol/L]顯著低于低氧+NaHS組、對照組[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05），但低氧+NaHS組、對照組大鼠的H2S含量之間的差異不顯著（P>0.05）。

2.3 三組大鼠肺動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達比較

低氧組大鼠肺小型肌性動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05），但低氧+NaHS組、對照組大鼠肺小型肌性動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達之間的差異均不顯著（P>0.05）；低氧組、低氧+NaHS組、對照組大鼠肺中型肌性動脈Ⅰ型膠原蛋白表達逐漸降低（P<0.05），低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動脈Ⅲ型膠原蛋白表達均顯著高于對照組（P<0.05），但低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動脈Ⅲ型膠原蛋白表達之間的差異不顯著（P>0.05），見表2。

2.4 三組大鼠肺動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達比較

低氧組大鼠肺小型肌性動脈、肺中型肌性動脈Ⅰ型膠原mRNA表達均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05），但低氧+NaHS組、對照組大鼠肺小型肌性動脈、肺中型肌性動脈Ⅰ型膠原mRNA表達之間的差異均不顯著（P>0.05）；低氧組、對照組、低氧+NaHS組大鼠肺小型肌性動脈、肺中型肌性動脈Ⅲ型膠原mRNA表達均逐漸降低（P<0.05），見表3。

3討論

低氧性肺血管重塑一方面包括細胞外基質的改變，另一方面也包括中膜平滑肌細胞的異常增殖。細胞外基質主要包括兩種成分，一種為彈性蛋白，一種為膠原蛋白[6-8]。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型等不同類型的膠原存在于血管壁中，其中血管壁的抗張力及韌性受Ⅰ型膠原直接而深刻的影響，而其彈性受Ⅲ型膠原直接而深刻的影響。在血管壁中，Ⅰ、Ⅲ型膠原占有極為重要的地位，在對血管的完整性維持方面發揮著極為重要的作用[9-13]。相關醫學研究表明[14]，大鼠肺動脈羥脯氨酸（代表膠原）含量特異性在HPH形成的情況下提升，進而一方面在極大程度上提升Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達，另一方面也在極大程度上提升其前膠原mRNA。因此，在低氧性肺血管重塑中，血管壁內Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的異常沉積是重要的病理過程。

迄今為止，低氧性肺血管結構重塑的形成機制尚不清楚。氣體信號分子如一氧化氮與一氧化碳具有快速產生、迅速彌散、作用廣泛等生物學特性， 它們的發現將肺動脈高壓發病機制研究帶入了新的階段。以往的研究提示[15-18]，一氧化氮和一氧化碳在低氧性肺血管結構重塑中發揮重要的調節作用。然而低氧性肺血管重塑的形成機制非常復雜，至今尚不明了。在諸多內源性生成的氣體分子中，探尋對心肺血管調節具有重要作用的新型氣體信號分子并揭示其對肺血管重塑的可能作用機制是該領域的重大前沿課題。本研究結果表明，低氧組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05）；低氧組大鼠的血漿H2S含量[（192±22）μmol/L]顯著低于低氧+NaHS組、對照組[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05）；低氧組大鼠肺小型肌性動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05）；低氧組、低氧+NaHS組、對照組大鼠肺中型肌性動脈Ⅰ型膠原蛋白表達逐漸降低（P<0.05），低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動脈Ⅲ型膠原蛋白表達均顯著高于對照組（P<0.05）；低氧組大鼠肺小型肌性動脈、肺中型肌性動脈Ⅰ型膠原mRNA表達均顯著高于低氧+NaHS組、對照組（P<0.05）；低氧組、對照組、低氧+NaHS組大鼠肺小型肌性動脈、肺中型肌性動脈Ⅲ型膠原mRNA表達均逐漸降低（P<0.05），與上述相關醫學研究結果一致。已有研究報道[19]，內源性H2S在體內可能有兩種存在形式，一種是氣體H2S形式，另一種則可能以NaHS形式存在。以NaHS形式存在的H2S容易保證溶液中H2S濃度的穩定， 文獻報道H2S的干預實驗多使用NaHS溶液[20]，因此本實驗中也采用了NaHS溶液來提供H2S。研究發現，補充NaHS后，大鼠血漿中H2S的含量升高，提示低氧時體內減少了的H2S得到了補充。

總之，大鼠低氧性肺血管重塑時硫化氫能夠有效抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表達，進而可能對低氧性肺血管重塑進行有效緩解，值得臨床充分重視。

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（收稿日期：2016-09-11）