血清ADAMTSL—1蛋白檢測在慢性肝病中的臨床價值初探

朱喆　高國生　柯葉芳

[摘要] 目的 探討血清ADAMTSL-1蛋白檢測在慢性肝病中的臨床意義。 方法 收集2016年2～4月在寧波市第二醫院肝病中心就診的80例慢性肝病患者作為實驗組，根據Child-Pugh評分分為A級32例，B級30例，C級18例，另外選擇24例健康體檢者作為正常對照組。檢測各組人群血清中的ADAMTSL-1蛋白濃度，并進行統計學分析。 結果 慢性肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白濃度為10.93（9.43～16.36）ng/mL，顯著高于正常對照組的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）；慢性肝病患者血清ADAMTSL-1蛋白濃度隨著Child-Pugh評分的升高而增加（F=12.33，P<0.01）。 結論 血清ADAMTSL-1蛋白有可能成為反映慢性肝病患者肝臟儲備功能的新指標。

[關鍵詞] ADAMTSL-1；ADAMTS家族；凝血酶敏感蛋白-1；慢性肝病；Child-Pugh評分

[中圖分類號] R575 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2016）36-0128-04

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of serum ADAMTSL-1 in chronic liver disease. Methods 80 cases of patients with chronic liver disease admitted to Liver Disease Center in Ningbo No.2 Hospital from February to April 2016 were collected as the experimental group. There were 32 cases of grade A， 30 cases of grade B and 18 cases of grade C according to the Child-Pugh score. In addition， 24 healthy subjects were selected as normal control group. The serum concentration of ADAMTSL-1 protein in each group was detected and analyzed statistically. Results The serum ADAMTSL-1 protein concentration in patients with chronic liver disease was 10.93（9.43-16.36） ng/mL， which was significantly higher than 7.53（6.91-8.17） ng/mL in the control group（t=5.47， P<0.01）. The serum ADAMTSL-1 protein concentration increased with the Child-Pugh score in chronic liver disease patients（F=12.33， P<0.01）. Conclusion Serum ADAMTSL-1 protein may be a new indicator of hepatic reserve function in patients with chronic liver disease.

[Key words] ADAMTSL-1； ADAMTS family； Thrombin sensitive protein-1； Chronic liver diseases； Child-Pugh score

含凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）重復基序的解聚素樣金屬蛋白酶超家族（ADAMTS super family）包括19種不同的ADAMTS蛋白和至少7種ADAMTS-like（ADAMTSL）蛋白[1]。ADAMTSL除不具有金屬蛋白酶和解聚素樣結構域外，含有其他ADAMTS的結構域，包括TSP-1。ADAMTSL沒有蛋白酶活性，且功能未知，其中一些成員被認為是細胞外基質（EMC）的組成成分[2]。

ADAMTSL-1是該家族的首個成員，是一類分泌性糖蛋白，因其在細胞外基質的分布呈顆粒狀而被稱為punctin-1[3]。ADAMTSL-1含有4個TSP-1，TSP-1與激活TGF-β關系密切[4]，而TGF-β又與肝病的發生發展相關[5，6]，但目前尚無ADAMTSL-1是否參與肝病進展的相關報道。本文以不同程度（Child-Pugh A、B、C）慢性肝病患者為研究對象，檢測血清中ADAMTSL-1蛋白濃度，探討血清ADAMTSL-1蛋白在慢性肝病中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續收集2016年2～4月在寧波市第二醫院肝病中心就診的各種原因所致的慢性肝病患者80例作為實驗組，男50例，女30例，平均年齡（57.49±12.66）歲。所有患者診斷標準依據中華醫學會2000年制訂的《病毒性肝炎防治方案》，其中，慢性HBV感染者63例，慢性HCV感染者2例，酒精性肝炎/肝硬化9例，藥物性肝炎/肝硬化6例。排除標準：（1）確診或可疑惡性腫瘤；（2）妊娠；（3）合并 HIV感染。根據入院時患者的肝性腦病情況、腹水的有無及其程度、血清總膽紅素、血清白蛋白和凝血酶原時間（PT）將肝臟儲備功能分為Child-Pugh A、B、C三級（5～6分為A級，7～9分為B級，10～15分為C級），其中A級32例，B級30例，C級18例。另選取24例無肝膽疾病的健康體檢者作為對照組，其中男16例，女8例，平均年齡（57.21±11.45）歲。實驗組和對照組的性別和年齡具有可比性。本研究由寧波市第二醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

對所有患者和健康對照組采集5 mL全血標本，1000 g離心15 min后，取上清液并置于-80℃保存。實驗前，所有標本室溫下復溶后再次離心以備檢測。ADAMTSL-1 ELISA試劑盒購自美國Cusabio公司，試劑批號：B24012221。酶標儀型號為德國西門子BEP-Ⅲ。采用生物素-親和素放大的ELISA（BA-ELISA）檢測血清中的ADAMTSL-1蛋白。在預包被抗ADAMTSL-1抗體的微孔板中加入待測血清和標準品，再依次加入生物素化的抗ADAMTSL-1抗體和HRP標記親和素，最后經底物顯色，并在450 nm波長下測定OD值。根據標準曲線求得待測血清ADAMTSL-1濃度。具體操作步驟見試劑說明書。

1.3 統計學處理

ADAMTSL-1濃度為呈偏態分布的計量資料，故用中位數（四分位數）表示，兩組和多組均數的比較采用t檢驗和方差分析（經開平方正態性轉換后）。采用SPSS16.0軟件分析數據，雙側檢驗P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 慢性肝病患者和正常對照組血清ADAMTSL-1蛋白比較

80例慢性肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白濃度為10.93（9.43～16.36）ng/mL，顯著高于正常對照組的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）。

2.2血清ADAMTSL-1蛋白在不同Child-Pugh 評分慢性肝病中的比較

血清ADAMTSL-1蛋白濃度隨著Child-Pugh評分的升高而增加（F=12.33，P<0.01），經LSD檢驗，Child-Pugh 評分A、B、C級之間的差異均有統計學意義（P均<0.05）。見圖1。

3討論

到目前為止，已有多個ADAMTS超家族中的成員被發現與肝病發展相關。ADAMTS13是肝臟分泌的一種金屬蛋白酶，主要由肝星狀細胞合成，其作用是通過降解vWF多聚體減少血栓的形成[7]。Uemura等[8]認為隨著肝臟功能的減退ADAMTS13活性和抗原含量逐步降低。而Wiese等[9]的研究發現肝硬化患者的ADAMTS13蛋白含量顯著高于對照組，但與Child-Pugh評分、門脈高壓和血流動力學無關。以上兩項研究的結論看似矛盾，其原因可能與前者研究對象大多為病毒性肝炎肝硬化且采集的血標本為來自外周靜脈，而后者病例大多為酒精性肝硬化且血液采集自肝靜脈和股動脈有關。另有研究指出慢性乙型和丙型肝炎患者血漿中ADAMTS13活性和含量的升高是發展成肝癌的危險因素[10]。ADAMTS-2、ADAMTS-3和 ADAMTS-14是前膠原N端蛋白酶，可通過剪切N末端前肽使前膠原發展為成熟膠原；三者都可通過裂解轉化因子結合蛋白1（Latent TGF-βbinding protein1，LTBP1）、TGF-β受體Ⅲ和前TGF-β而起到調節TGF-β信號的作用[11]。李漢軍等[12]也通過免疫組化和Western blot檢測到ADAMTS-2和TGF-β1在肝硬化組織中的表達比正常肝組織明顯升高，從而推測兩者可能存在協同致肝纖維化作用。

在過去的研究中發現ADAMTSL蛋白并不是由ADAMTS基因的剪接變體所產生的，它們由獨立的基因編碼，如ADAMTSL-1編碼基因位于人類染色體9p21-22[3]，ADAMTSL-3編碼基因位于人類染色體15等[13]。ADAMTSL-1蛋白含有497個氨基酸，含有1個信號肽、4個TSP-1、1個半胱氨酸富集區域、1個間隔區域和1個N-連接糖基化位點。研究指出ADAMTSL-1蛋白的TSP-1中含有O-連接巖藻糖基化位點和C-甘露糖基化位點，抑制兩者糖基化會減少ADAMTSL-1蛋白的分泌。由此推測O-連接巖藻糖基化和C-甘露糖基化可能作為翻譯后修飾而影響該蛋白的生成[2，14]。ADAMTSL-1蛋白主要表達在骨骼肌，而其小信使RNA也可見于其他組織（如心臟、結腸、腎臟、肝臟）[3]。Campbell等[15]通過對小鼠骨肉瘤模型注射Hh通路抑制劑IPI-926減弱骨肉瘤的增殖，同時發現ADAMTSL-1表達降低，認為ADAMTSL-1可能作為Hh通路的調控基因改變了骨肉瘤的發展。在秀麗隱桿線蟲中，與哺乳動物ADAMTSL-1同源的MADD-4通過導素受體UNC-40/DCC發揮作用[16]。DCC與細胞凋亡和腫瘤形成相關[17，18]，由此也推測ADAMTSL-1參與了腫瘤的發生發展。

到目前為止，包括ADAMTSL-1在內的ADAMTSL蛋白家族功能仍然未知，特別是其與慢性肝病的關系未見有報道。Hirohata等[3]認為這類蛋白可能通過競爭ADAMTS的底物而表現出與ADAMTS蛋白相拮抗。Drechsler等[19]在黑腹果蠅中發現與ADAMTSL同源的Loh可通過與Prc膠原結合而在心肌的細胞外基質形成過程中起關鍵作用，表明ADAMTSL在進化過程中非常保守，并可能通過與膠原的結合而參與細胞外基質的形成。另一方面，已發現多種ADAMTSL基因突變與疾病相關，如ADAMTSL-4基因突變被認為是常染色體隱性的孤立性晶狀體異位（autosomal recessive isolated ectopialentis，IEL）的主要因素[20]；而ADAMTSL-2基因突變與一種表現為身材矮小、指短、皮厚和心瓣膜異常的罕見肌發育不良（geleophysic dysplasia）有關[21]。

原纖蛋白-1（fibrillin-1）是組成細胞外基質的主要成分，與TGF-β關系密切，而后者又是肝硬化最相關的細胞因子。TGF-β可促進原纖蛋白1的表達，而原纖蛋白1參與構成的LTBPs又是活性TGF-β的重要來源[22，23]。ADAMTSL-2、3、6已被發現可以與原纖蛋白1結合，是形成微纖維的重要調節分子[24，25]。Hubmccher等[24]認為ADAMTSL蛋白可能參與了TGF-β的信號通路，提示我們值得對ADAMTSL家族做進一步的研究。

在本研究中，我們發現慢性肝病患者血清中ADAMTSL-1的濃度顯著高于健康對照組，且隨著Child-Pugh評分的增加而升高，各級之間存在著顯著性差異，表明ADAMTSL-1蛋白可能參與慢性肝病的進展。然而本研究也存在一定的缺陷，如（1）病例數較少，尤其是Child-Pugh評分B、C級的患者數量不足；（2）因樣本數量的限制未能研究該蛋白與肝癌的相關性。所以未來的研究中我們需進行大樣本量實驗，并將肝癌患者納入研究，也許ADAMTSL-1蛋白能成為反映慢性肝病患者肝臟儲備功能和預后的新指標。

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（收稿日期：2016-07-19）