超聲波提取法與水煎提取對五倍子體外抑菌效果的影響

李澤英 黃翔 劉北華 潘進良

摘要：本實驗以五倍子作為試供藥物，黃芩為對照組，研究超聲波與水煎提取對五倍子體外抑菌效果的影響，采用平皿打洞法測定五倍子對金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌等四種常見禽畜致病菌的體外抑菌活性，并用二倍稀釋法測定五倍子對四種細菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。試驗結果顯示：與水煎法相比較，超聲波提取法對五倍子體外抑菌效果的提高并不明顯。

關鍵詞：五倍子；水煎法；超聲波提取法；體外抑菌

中圖分類號：S859 文獻標識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）09-0006-01

1研究的目的和意義

通過比較超聲波與水煎提取方法對五倍子的體外抑菌效果，為超聲波提取其他中藥材提供一定的試驗依據(jù)。

2研究方法

2.1藥液制備

水煎提取法：分別稱取五倍子、黃連、黃芩各10g，加蒸餾水100mL，浸泡30min，再將藥材連同浸泡的水置于高壓鍋內用102℃，蒸煮20min，之后將蒸煮液過濾到另一個燒杯中，再往藥渣的燒杯中加入蒸餾水100mL，再次置于高壓鍋中用102℃，蒸煮20min，第2次過濾蒸煮液，然后合并2次蒸煮液，用離心機進行離心，離心速度是4000r/min，離心10min，取上清液進行濃縮，制備成藥液濃度為1g/mL的蒸煮液，然后置于高壓滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度120℃，滅菌時間30min，最后用牛皮紙封口，放置在4℃的冰箱中備用。

超聲波提取法：分別稱取五倍子、黃連、黃芩各10g，加蒸餾水100mL，浸泡30min，再將藥材連同浸泡的水置于超聲波提取器中，用20kHz頻率提取20min，之后將提取液過濾到另一個燒杯中，再往藥渣的燒杯中加入蒸餾水100mL，再次置于超聲波提取器中，用20kHz頻率提取20min，第2次過濾提取液，然后合并兩次提取液，用離心機進行離心，離心速度是4000r/min，離心10min，取上清液進行濃縮，制備成藥液濃度為1g/mL的提取液，然后置于高壓滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度120℃，滅菌時間30min，最后用牛皮紙封口，放置在4℃的冰箱中備用。

2.2抑菌活性測定

采用平皿打孔法測定供試菌株對供試中藥敏感度，具體操作步驟：先在無菌平皿中倒入3～4 mm厚的營養(yǎng)瓊脂，待瓊脂冷卻凝固后，用滅菌棉簽蘸取供試菌液均勻涂布在瓊脂表面，再用無菌玻璃打孔器（直徑6mm）在平皿內均勻打5個孔，然后用滅菌針頭除去孔內瓊脂并適當封閉孔底，最后用滅菌注射器加入供試藥液，以滿而不溢為宜，做好標記后置于37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察結果。若有抑菌作用，則小孔周圍出現(xiàn)無細菌生長的抑菌圈，用游標卡尺測量度抑菌圈直徑。抑菌圈直徑小于10mm為耐藥，10～15mm為中度敏感，大于15mm為高度敏感。

同樣方法做2個平行測定，并計算抑菌圈平均值，剩下的一個孔不加藥液做空白對照。

2.3最小抑菌濃度測定

在超凈工作臺中取無菌試管8支，1號管中加入1.8mL營養(yǎng)肉湯，2～8號管中各加入1mL營養(yǎng)肉湯，用移液槍吸取已經(jīng)制備好的濃縮藥液0.2mL，加入1號管中混勻后，在1號管中吸取1mL混合液加入2號管中混勻，再在2號中吸取1mL混合液加入3號管中，依次倍比稀釋至7號管，混勻后自7號管中棄去1mL混合液，8號管不加菌液作為空白對照管。此時，各管藥液濃度分別為100.0mg/mL、50.0mg/mL、25.0mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.5625mg/mL、0mg/mL。將肉湯培養(yǎng)8h的菌液，用無菌肉湯稀釋至10～3濃度，然后各管均加入菌液0.2mL，混勻后，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)18h，觀察結果，若肉湯混濁，表示菌液生長，若肉湯清亮，表示無細菌生長。

2.4最小殺菌濃度測定

將上述MIC測定中2～7號管中的肉湯接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，做好標記，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)18h，觀察結果，以平板中有無菌株生長為標準，以無菌株生長的最低濃度作為該藥的最小殺菌濃度（MBC）。

3試驗結果

3.1抑菌活性的測定結果

除多殺性巴氏桿菌外，超聲波提取法均提高了五倍子對其他試供菌的體外抑菌效果；五倍子的超聲波提取液對埃希氏大腸桿菌呈高度敏感，而其水煎液僅僅呈現(xiàn)中度敏感；對埃希氏大腸桿菌和沙門氏菌，五倍子超聲波提取液抑菌效果的提高較為顯著。除沙門氏菌外，超聲波提取法均提高了黃芩對其他試供菌的體外抑菌效果。

3.2最小抑菌濃度（MIC）的測定結果

超聲波提取法僅降低了五倍子對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度，而對其他3種細菌的最小抑菌濃度沒有影響。超聲波提取法降低了黃芩對埃希氏大腸桿菌的最小抑菌濃度，不能確定是否影響了黃芩對金黃色葡萄球菌和多殺性巴氏桿菌的最小抑菌濃度測定。

3.3最小殺菌濃度（MBC）的測定

超聲波提取法僅降低了五倍子對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度，而對其他3種細菌的最小殺菌濃度沒有影響。黃芩水煎液的最小殺菌濃度要比超聲波提取液的最小殺菌濃度小，不能確定超聲波提取法是否影響了黃芩對多殺性巴氏桿菌的最小殺菌濃度。

相對于水煎法，超聲波提取法對五倍子體外抑菌效果的提升并不明顯。

參考文獻

[1]趙麗東， 張華峰， 董靜洲， 等. 淫羊藿苷的超聲波強化提取及其穩(wěn)定性初探[J]. 西北農業(yè)學報， 2007， 16（6）： 285-288.