不同桂花品種開花及衰老過程中的花色物質成分分析

鄒晶晶　曾祥玲　陳洪國　蔡璇　王彩云

摘要：[目的]分析不同花色桂花品種開花及衰老過程中的花色物質成分及其含量變化規律，為桂花花色資源開發和利用提供參考依據。[方法]分別選取代表橙色品種群的鎘橙丹桂、代表黃白色品種群的厚瓣銀桂和代表黃色品種群的柳葉金桂，運用高效液相色譜質譜法檢測其開花過程中的花色物質組分及含量，用色差儀測定花色參數L*（顏色亮度）、a*（紅/綠程度）、b*（黃/藍程度）和c*（彩度），用多元線性回歸分析法逐步篩選分析花色呈現與特征花色物質含量的關系；分析不同花色桂花品種衰老過程中特征花色物質含量的變化規律。[結果]桂花中含有5種黃酮類物質，可能為金魚草素苷元、槲皮素苷元、芹菜素苷元、鼠李金苷元和柚皮素苷元，其中槲皮素苷元在鎘橙丹桂、厚瓣銀桂和柳葉金桂盛花期花瓣中的含量均較高，分別為134.55、89.41和90.39 ug/gFW。對a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素進行定量分析發現，兩種類胡蘿卜素僅在鎘橙丹桂中含量較高，分別為72.94和99.72 yg/gFW。對花色呈現與花色物質含量關系的分析結果顯示，槲皮素苷元決定花色的亮度L*，柚皮素苷元決定黃色程度b*，B-胡蘿卜素決定紅色程度a*。其中，槲皮素苷元含量在鎘橙丹桂、厚瓣銀桂和柳葉金桂開花過程中均呈先降低后升高的變化趨勢，B-胡蘿卜素含量在鎘橙丹桂開花過程中呈明顯的先升高后降低的變化趨勢，柚皮素苷元含量在柳葉金桂開花過程中呈緩慢上升趨勢。[結論]槲皮素苷元、柚皮素苷元及B-胡蘿卜素為桂花的特征花色物質，其在鎘橙丹桂、厚瓣銀桂和柳葉金桂開花及衰老過程中的變化規律共同決定了不同花色桂花品種花色明亮度具有隨著花朵開放時間推移呈先加深后逐步黯淡的特征，而基本花色不產生明顯變化。

關鍵詞：桂花；花色；特征花色物質；高效液相色譜質譜法

0引言

[研究意義]桂花（Osmanthus fragrans Lour.）是我國十大傳統名花之一，自古享有“獨占三秋壓眾芳”的美譽（劉玉蓮，1985）。桂花花瓣中營養成分豐富，含多種維生素、微量元素和人體必需氨基酸，又有“百花營養之王”的美稱（李軍峰，2011）。桂花樹也是我國重要的天然保健植物和特產經濟香花植物，因其花香氣濃郁，在食品、藥用、香妝及天然色素提取等領域應用前景廣闊（Cai et al.，2014；曾祥玲等，2016）。目前，關于桂花天然色素的研究多集中在提取工藝的探討方面，對桂花具體花色物質成分及其在采收過程中變化規律的研究較少（侯丹，2014），對桂花開放及衰老過程中花色物質成分的變化規律尚未清楚。因此，提取桂花花色物質成分并分析其含量變化規律，對桂花分子育種、花色資源開發及及利用具有重要意義。[前人研究進展]桂花可根據不同品種的開花習性和顏色歸為兩大類四大品種群，即秋天開花秋桂類的金桂、銀桂、丹桂三大品種群和四季開花的四季桂品種群（向其柏和劉玉蓮，2008）。蔡璇等（2010）、Han等（2014）、張超等（2016）研究發現，桂花花瓣中的色素為類黃酮和類胡蘿卜素，其中黃白色花以類黃酮化合物為主；橙色花中類胡蘿卜素的種類及含量影響秋桂花色的呈現。此外，Chan等（2011）研究發現，植物體在不同發育階段的物質代謝水平會發生變化，而導致不同品種或同一品種在不同開花時期花色及花香成分存在差異；陽韶昆等（2012）、zou等（2014）研究發現，桂花花瓣衰老過程中存在細胞程序性死亡現象，如蛋白酶活性減弱、核DNA斷裂及染色質凝結等。[本研究切人點]四季桂品種群桂花的顏色較單一（黃色），秋桂類三大品種群桂花的顏色從橙紅色到黃色到黃白色差異較明顯，但目前關于不同花色桂花品種花色物質在其衰老過程中變化規律的研究鮮見報道。[擬解決的關鍵問題]選擇同一生長地秋桂類不同花色桂花品種群鎘橙丹桂（D.fragrans‘Gecheng Dangui）（橙色）、厚瓣銀桂（D.fragrans‘Houban Yingui）（黃白色）和柳葉金桂（D.fragrans‘Liuye Jingui）3個花色代表品種，采用高效液相色譜質譜法檢測其花色物質組分及含量差異，并測定花色參數L。（顏色亮度）、a*（紅/綠程度）、b*（黃/藍程度）和C*（彩度），分析與花色呈現密切相關的特征花色物質，進一步測定其在桂花開花過程中的變化規律，為桂花花色分子機理研究、花色資源開發及利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試3個花色桂花品種群代表品種分別為丹桂品種群的鎘橙丹桂（橙色）、銀桂品種群的厚瓣銀桂（黃白色）和金桂品種群的柳葉金桂（黃色），以其盛花期的花瓣（圖1）為試驗材料，進行特征花色物質的提取、分離、鑒定及色差分析。

主要儀器設備：高效液相色譜質譜聯用儀（日本島津公司），SPD-M20A二極管陣列檢測器，CTO-20AC色譜柱控溫箱，SIL-20AC自動進樣器，DGU-20A3脫氣裝置，LC-20AD二元梯度泵，柯尼卡美能達色差計（CM-2002，日本柯尼卡美能達公司），超純水制備設備（法國密理博公司），BP210S電子分析天平（德國賽多利斯集團）。

試劑：乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）為色譜純（美國天地試劑有限公司）；磷酸、甲酸、氫氧化鉀（KOH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、三乙胺（TEA）、氯化鈉（NaCl）、乙醇和丙酮均為分析純（國藥集團）；綠原酸、芹菜素、柚皮素及B-胡蘿卜素標樣購自美國sigma公司，蘆丁標樣購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2試驗方法

桂花于2015年9月20-25日在華中農業大學（湖北武漢）校園苗圃內采集。選擇生境一致、長勢良好的成年植株，分別于鈴梗期（花苞期）、初花期、盛花期及末花期采集花瓣，采樣時間為上午7：00-9：00。花期判斷參照周媛（2008）的花期劃分體系標準進行劃分。

1.2.1花色物質類黃酮提取及HPLC-MS分析 參照蔡璇等（2010）的方法，稱取0.5 g桂花花瓣，用10mL 50%乙醇溶液避光浸提3 h后，將得到的提取液用微孔濾膜（0.45 wn）過濾，供高效液相色譜分析用。色譜柱為日本維美希（YMC）公司的C18柱（150.0mmx4.6 mm），型號為Jsphere ODS-H80Ts QA。

色譜條件：參照葛雨萱等（2008）的方法，進樣體積30uL，檢測器波長320 nm。質譜條件：電噴霧離子化（ESI），離子阱分析器，正離子或負離子檢測模式，全離子掃描，掃描范圍100-700 Da，電噴霧接口干燥氣（N2）流速1.5 L/min，毛細管電壓4500 v，錐孔電壓1600 v，干燥溫度200℃，用儀器附帶的LC/MSSolution 3.41分析質譜結果，根據保留時間、最大吸收波長及一級質譜分子離子峰得到的分子量計算出其元素組成，通過化學結構數據庫（http：//www.chemspider.com/）檢索得到可能的化學結構。

1.2.2花色物質類胡蘿卜素提取及HPLC-MS分析參照蔡璇等（2010）的方法，稱取1.0 g桂花花瓣，用10 mL丙酮：乙醇（1：1）溶液避光浸提3 h。參照郭琳琳（2007）的方法（有所改進）進行桂花類胡蘿卜素花色物質HPLC-MS分析。先將上述得到的提取液在弱光或避光條件下進行皂化，將色素溶液旋轉蒸發后溶于2 mL MTBE（含0.01%BHT），再加2 mL10%KOH-甲醇溶液（含0.01%BHT）充氮，避光條件下皂化10 h，加4 mL飽和NaCl水溶液和2 mL MTBE（含0.01%BHT）使之能更好地分層。將上清液真空濃縮后用1 mL MTBE（含0.01%BHT）溶解定容。定容后的提取液用微孔濾膜（0.45 pm）過濾，供高效液相色譜分析用。高效液相色譜質譜聯用儀等裝置及質譜條件同1.2.1。

色譜柱為日本維美希（YMC）公司的C30柱（250.0 mm×4.6 mm）。色譜條件：柱溫35℃，流速1.0 mL/min，進樣體積20uL，檢測器波長450 nm。

1.2.3花色物質定量分析 對有標樣的花色物質組分，利用外標法定量，大部分類黃酮組分取320 nm響應值定量，大部分類胡蘿卜素組分取450 nm響應值定量。對未標樣的組分，利用距離該組分峰保留時間最近的標樣估算其相對含量。

1.2.4花色測量 3個花色桂花品種各取5個花序，從每個品種的每個花序中隨機取6枚花瓣，用色差儀的集光孔對準花瓣中央測量其L*、a*、b*和C*，每枚花瓣測3次，取平均值。

1.3統計分析

試驗數據采用SAS v8.0進行方差分析和多重比較。

2結果與分析

2.1類黃酮類花色物質的定性分析結果

從圖2可看出，桂花花瓣中共鑒定出5種類黃酮化合物，分別標記為F1-F5。不同花色桂花品種的F1-F4出峰時間及其光譜圖基本一致，但不同花色品種中各花色物質的含量存在差異，如F5在黃色花的柳葉金桂及黃白色花的厚瓣銀桂中出峰明顯，在橙色花的鎘橙丹桂中出峰不明顯。此外，3個品種中F2含量均最高，明顯高于其他幾種物質含量。說明在不同花色桂花品種中黃酮類物質的種類和含量有所不同。

由表1可知，在檢出的5種黃酮化合物中，F2含量最高，其分子離子峰分別為m/z 579（[M-H]-）和m/z 301（[M-H-132-146]）。m/z 301（[M-H-132-146]。）可能是失去一個戊糖132和一個脫氧己糖146所得的碎片，因此，該組分可能是以槲皮素為母體色素的苷類物質；F5是明顯存在于柳葉金桂和厚瓣銀桂中的色素峰，在鎘橙丹桂中難以檢測到，其分子離子峰主要為m/z 435（[M+H]+）和m/z 273（[M+H-162]+），m/z 273（[M+H-162]+）可能是失去一個己糖所得的碎片，由此推論該色素可能是柚（苷）配基化合物；F1、F3和F4在3個花色桂花品種中含量均不高。F1的分子離子峰主要為m/z 371（[M+H]+）和m/z 287（[M+H-2×42]+），m/z 287（[M+H-2x42]+）可能是失去兩個乙二醛所得的碎片，因此，初步判斷F1為以金魚草素為母體的色素物質；F3的分子離子峰主要有m/z 433（[M+H]+）和m/z 271（[M+H-162]+），m/z 271（[M+H-162]+）可能是失去一個己糖所得的碎片，因此，F3可能是含有芹菜素甙元的黃酮類色素物質；F4的主要離子碎片有m/z 340（[M+H]+）和m/z317（[M+H-23]+），m/z 317（[M+H-23]+）是失去一個鈉所得的碎片，推斷F4為含有鼠李金甙元的色素成分。綜上所述，桂花花瓣中檢測到的5種黃酮類物質可能為金魚草素苷元、槲皮素苷元、芹菜素苷元、鼠李金苷元和柚皮素苷元。

2.2類胡蘿卜素類花色物質的定性分析結果

從圖3可看出，鎘橙丹桂花瓣色素在450 nm波段明顯有兩個峰，而柳葉金桂和厚瓣銀桂未在該波長內分離到相應的明顯峰，說明柳葉金桂和厚瓣銀桂中類胡蘿卜素物質含量可能很低。對比Balder-mann等（2010）研究報道的丹桂品種中主要含a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素兩種類型且占總類胡蘿卜素物質含量在90%以上的結論，結合本研究中類胡蘿卜素成分的特征吸收峰推斷，鎘橙丹桂中所檢測到的類胡蘿卜素物質C1為a-胡蘿卜素，C2為B-胡蘿卜素。

2.3花色物質的定量分析結果

根據質譜鑒定結果，用外標法進行定量分析，對無相同苷元標樣的成分用出峰位置臨近的標樣代替。F1金魚草素苷元選擇綠原酸標樣定量；F2槲皮素苷元選蘆丁標樣定量；F3芹菜素甙元選擇芹菜素標樣定量；F4鼠李金甙元選擇蘆丁標樣定量；F5柚皮素苷元選擇柚皮素標樣定量。

由表2可知，在檢測出的類黃酮類色素物質中，槲皮素苷元是3個桂花品種中含量最高的成分，且在鎘橙丹桂花瓣中的含量（134.55 ug/gFW）顯著高于厚瓣銀桂和柳葉金桂（P<0.05，下同），厚瓣銀桂的槲皮素苷元含量與柳葉金桂無顯著差異（P>0.05，下同）；鎘橙丹桂的金魚草素苷元類色素物質含量為6.07 lag/gFw，顯著高于其他兩個品種；厚瓣銀桂和柳葉金桂的柚皮素苷元類物質含量均較高，分別為13.98和15.00 ug/gFW，顯著高于鎘橙丹桂；3個品種的芹菜素苷元及鼠李金苷元含量無顯著差異。

由表2還可看出，橙色的鎘橙丹桂中檢測到的a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素含量最高，分別為72.94和99.72 ug/gFW，顯著高于另兩個桂花品種；在黃白色的厚瓣銀桂中檢測到的a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素含量最低，分別為11.81和12.06ug/gFW；在黃色的柳葉金桂中檢測到的a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素含量分別為24.84和27.90 ug/gFW。說明a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素是桂花中最主要的類胡蘿卜素類物質，且主要存在于橙色花的丹桂品種中。

2.4花色物質組成與花瓣呈色的關系分析

由表3可知，花色由淺到深分別為黃白色、黃色和橙色，其相應的RHSCC（英國皇家園藝學會比色卡）變幅為2C-25B；3個桂花品種的L*變幅為65.51-73.18（其中，鎘橙丹桂的L*最低，其他兩個品種的L*均高于70.00），差異不明顯；黃色花柳葉金桂的a*和b*均低于其他兩個品種，黃白色花厚瓣銀桂的C*在3個品種中最低。說明3個桂花品種顏色的鮮亮程度相似，而橙色鎘橙丹桂比黃色柳葉金桂和黃白色厚瓣銀桂的顏色更偏紅或黃。

以花色測量值為因變量，花色物質組成含量為自變量，采用逐步篩選多元線性回歸統計方法，分析桂花的花色物質組成與花瓣呈色的相關性，統計結果如下：

L*=-0.16707F2+87.98659（R=0.9990）

a*=0.25805C2-9.66094（R=0.9989）

b*=-0.80116F5+45.78575（R=0.9819）

可見，桂花的花色呈現與類黃酮化合物和類胡蘿卜素化合物均有一定的關系。其中，L*與黃酮類化合物槲皮素苷元（F2）含量呈負相關，表明槲皮素苷元含量的增加可能使桂花花色變暗；a*與B-胡蘿卜素（C2）含量呈正相關，表明B-胡蘿卜素含量的增加可能是桂花花瓣呈現紅色的關鍵；b*與類黃酮類物質柚皮素苷元（F5）含量呈負相關，表明柚皮素苷元含量的增加可能使桂花花瓣黃色變淺。說明槲皮素苷元、柚皮素苷元及B-胡蘿卜素為桂花衰老過程中的特征花色物質。

2.5不同桂花品種開花過程中花色物質的變化

由表4可知，橙色鎘橙丹桂的槲皮素苷元含量在其開花及衰老過程中呈先降低后升高的變化趨勢，以初花期最低，為24.50 ug/gFW，而末花期最高，為224.81 ug/gFW，是初花期該物質含量的9倍多；柚皮素苷元含量較低，總體上呈緩慢上升趨勢，在末花期時含量達最大值，為9.11 ug/gFW，而B-胡蘿卜素含量在其開花及衰老過程中呈先升高后降低的變化趨勢，在鈴梗期時含量最低，為28.07 pg/gFW，在盛花期最高，為99.72 pg/gFW，在末花期下降為61.47 pg/gFW。

黃白色厚瓣銀桂的槲皮素苷元含量在其開花及衰老過程中的變化趨勢與鎘橙丹桂相似。從鈴梗期到初花期，槲皮素苷元含量從73.13 ug/gFW顯著降至32.24ug/gFW，盛花期升高至89.41ug/gFW，末花期繼續上升，達最大值（153.76 ug/gFW）；柚皮素苷元含量呈先緩慢上升后下降的變化趨勢，鈴梗期為4.73ug/gFW，初花期上升至5.92 ug/gFw，盛花期達最大值（13.98 ug/gFW），末花期下降至12.02ug/gFW；B-胡蘿卜素含量在整個開花及衰老過程中基本上處于穩定狀態。

黃色柳葉金桂的槲皮素苷元含量在其開花及衰老過程中呈先下降后上升的變化趨勢，從鈴梗期到初花期，其含量從94.25ug/gFW顯著下降至36.45ug/gFW，盛花期迅速升高至90.39 ug/gFW，末花期達最大值（1 37.50 ug/gFW）；柚皮素苷元含量在整個開花及衰老過程中呈顯著升高的變化趨勢，初花期最低值為7.75 ug/gFW，末花期最高值為35.52 ug/gFW；B-胡蘿卜素含量在開花及衰老過程中呈平緩上升后略下降的變化趨勢，在盛花期達最大值（27.90ug/gFW），顯著高于其他幾個時期。

綜上所述，與花色亮度值呈負相關的槲皮素苷元含量在3個不同花色品種桂花開花過程中均呈先降低后升高的變化趨勢，與紅色相關的B-胡蘿卜素含量在鎘橙丹桂開花過程中呈明顯的先升高后降低趨勢，與黃色相關的柚皮素苷元含量在柳葉金桂開花過程中呈緩慢上升趨勢。這三類物質的變化規律共同決定了3個不同花色桂花品種開花過程中基本花色不產生明顯變化，而花色明亮度隨著花朵開放時間的推移呈先加深后變黯淡的特征。

3討論

類黃酮是最廣泛且成分十分豐富的花色物質，不同的類黃酮成分對花色形成的貢獻不同。本研究從3個桂花品種花瓣中檢測到的5種類黃酮類花色物質，可能為金魚草素苷元、槲皮素苷元、芹菜素苷元、鼠李金苷元和柚皮素苷元等。其中，金魚草素苷元因其最初在金魚草中發現而得名，對亮黃色的呈現有重要貢獻（Tanaka et al.，2008）；槲皮素苷元常以與葡萄糖或蕓香糖結合的形式存在，已在臘梅等黃色花植物中檢測到（葛雨萱等2008）。候丹（2014）從桂花中檢測出8種類黃酮物質，其中定性分析出槲皮素、異鼠李素、丁香亭、芒柄花素等類黃酮物質。本研究與其檢測出的類黃酮物質成分種類存在差異，可能是對黃酮類物質提取方法和檢測條件不同引起。

多數類胡蘿卜素類色素物質呈不同程度的黃色或紅色，常見的類胡蘿卜素類物質有番茄紅素、六氫番茄紅素、八氫番茄紅素、紫黃質、玉米黃質、隱黃質、葉黃素、a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素等（Tanaka and Ohmiya，2008；Tanaka et al.，2008）。但許多植物的類胡蘿卜素成分較單一，如宮燈百合（Sandersonia aurantiaca）中的類胡蘿卜素主要為隱黃質、玉米黃質和B-胡蘿卜素（Nielsen et al.，2003），萬壽菊和菊花中的類胡蘿卜素主要為葉黃素及其衍生物（Moehset al.，2001；Kishimoto et al.，2004）。本研究發現，橙色鎘橙丹桂中的類胡蘿卜素類物質主要是a-胡蘿卜素和B-胡蘿卜素，與Baldermann等（2010）、候丹（2014）的研究結果相似。

植物不同花色的呈現多與花器官中花色組分差異有關。張紅磊（2011）研究認為，牡丹花的總花青素含量與L*呈極顯著負相關，與a*呈極顯著正相關，即隨花青素化合物含量增加，花瓣的亮度降低，花色加深。洪艷等（2012）研究發現，菊花眾多品種中粉紅色系品種呈現的粉紅色主要與花青素苷類中的矢車菊素苷含量有關，白黃色系品種中白黃色的呈現主要與類胡蘿卜素含量相關。與上述研究結果不同，本研究中的桂花花瓣不含花色素苷，花色的呈現主要與類胡蘿卜素和類黃酮化合物有關；a*與B-胡蘿卜素含量呈正相關，即隨著B-胡蘿卜素含量的增加，桂花花瓣紅色加深；b*在正數范圍內與柚皮素苷元含量呈負相關，即隨著柚皮素苷元含量的增加，桂花花瓣黃色變淺；槲皮素苷元含量與L*呈負相關，即隨著槲皮素苷元含量的增加，桂花花瓣亮度降低。由此可見，不同物種花色的呈現，因其所含有的不同花色物質種類及含量水平而異。

4結論

槲皮素苷元、柚皮素苷元及B-胡蘿卜素為桂花開花及衰老過程中的特征花色物質。與花色亮度值呈負相關的槲皮素苷元含量在3個不同花色品種桂花開花過程中均呈先降低后升高的變化趨勢，與紅色相關的B-胡蘿卜素含量在鎘橙丹桂開花過程中呈明顯的先升高后降低趨勢，與黃色相關的柚皮素苷元含量在柳葉金桂開花過程中呈緩慢上升趨勢，這三類物質的變化規律共同決定了不同花色桂花品種開花過程中花色明亮度具有隨著花朵開放時間推移呈先加深后逐步黯淡的特征，而基本花色不產生明顯變化。