野生和人工培養紅貝俄氏孔菌化學成分及抑菌活性測定

盧衛紅　朱峰　吳善瑩　洪茵

摘要：[目的]考察不同培養基對紅貝俄氏孔菌乙酸乙酯提取物化學成分及抑菌活性的影響，為紅貝俄氏孔菌的人工培養提供理論依據。[方法]分別用葡萄糖酵母膏蛋白胨培養基（GYP）和綜合馬鈴薯培養基（CPDA）對紅貝俄氏孔菌進行人工培養，采用乙酸乙酯提取菌絲體和發酵液化學成分，通過氣相色譜一質譜聯用技術（GC-MS）對比分析野生和人工培養紅貝俄氏孔菌乙酸乙酯提取物的化學成分，通過微量稀釋培養法評價野生菌和人工培養紅貝俄氏孔菌乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性。[結果]GC-MS分析結果表明，野生菌和培養菌絲體乙酸乙酯提取物的主要成分為棕櫚酸甲酯、棕櫚酸和油酸等，其中，從野生菌檢測出13種成分，含量較高的主要成分是亞油酸甲酯（18.522%）、棕櫚酸甲酯（15.976%）和棕櫚酸（11.164%）；產品GYP培養菌絲體共檢出13種成分，含量較高的主要成分是棕櫚酸（28.677%）、油酸（15.108%）和棕櫚酸甲酯（8.983%）；從CPDA培養菌絲體共檢出14種成分，含量較高的主要成分是棕櫚酸甲酯（22.575%）、棕櫚酸（17.643%）和硬脂酸甲酯（4.787%）；有7種相同成分共同存在于3種提取物中，有3種成分僅在野生菌中檢測到，有7種成分僅在培養菌絲體中發現。從GYP培養液中共檢出9種成分，含量較高的主要成分是十八甲基環壬硅氧烷（4.663%）、1-十九碳烯（2.423%）和（E）-3-十八碳烯（1.785%）；從CPDA培養液中共檢出14種成分，含量較高的主要成分是棕櫚酸（12.913%）、（z，E）-2，13-十八碳二烯-1-醇（5.985%）和棕櫚酸甲酯（5.591%）。體外抑菌試驗結果表明，GYP培養液提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，其最低抑菌濃度（MIC）為0.80 mg/mL，其余提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均為1.60 mg/mL。[結論]可采用GYP和CPDA作為培養基對野生紅貝俄氏孔菌進行規模培養，以解決野生紅貝俄氏孔菌資源不足的問題。

關鍵詞：紅貝俄氏孔菌；化學成分；氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）；抑菌活性

0引言

[研究意義]大多數木生真菌除了具有降解木質纖維素的功效外，還因含有多種活性成分而具有多種藥用價值（戴玉成，2009；戴玉成和崔寶凱，2010）。紅貝俄氏孑L菌[Earliella scabrosa（Pers.）Gilb.&Ryvarden]為木生菌，屬多孔菌科（Polyporaceae）俄氏孔菌屬（Earliella sp.），具有鎮驚、活血、止血、療風、止癢等藥用功效（鄧春英等，2013）。由于野生紅貝俄氏孑L菌資源收集困難，目前對該菌的開發利用還非常有限。因此，研究利用人工培養物替代野生子實體進行紅貝俄氏孔菌活性成分的開發利用具有重要現實意義。[前人研究進展]高等真菌化學成分因種類、菌株、培養基組成和菌齡的不同而有所差異，且菌絲體與子實體、菌蓋與菌柄之間的化學成分也存在差異（姚秋生，2011）。在高等真菌培養條件研究方面，李德舜等（2008）以抗金黃色葡萄球菌活性為指標，對楊樹菇液體發酵培養基和培養條件進行優化研究，獲得了最佳培養基。冀瑞卿等（2012）經前期試驗驗證鵝膏菌菌株AV對楊樹爛皮病病原菌金黃殼囊孢菌有抑制作用，通過比色法和生物量測定結果得出其抑菌物質產生的最佳營養條件。蟲草素是蛹蟲草的主要有效化學成分，其最佳培養基為以大米、玉米等作主料，另添加10%-25%的蠶蛹粉或奶粉提高蛹蟲草子實體的品質（譚琪明，2014）。李羿等（2016）分別以營養培養基、藥性培養基和復合藥性培養基為初始發酵培養基，比較天然茯苓、發酵茯苓、藥性發酵茯苓和復合藥性發酵茯苓等不同茯苓樣品化學成分的差異，發現不同初始發酵培養基對茯苓液體發酵有較大影響，不同來源茯苓間的化學成分存在明顯差異。目前有關紅貝俄氏孔菌的研究主要集中在生物降解、抗菌活性和精油成分分析方面。Guem等（2008）、Lyra等（2009）研究發現，E.scabrosa對合成染料具有很好的脫色效果。Peng和Don（2013）通過搖瓶培養E scabrosa，發現其培養菌絲水提取物和甲醇提取物對受試橡膠樹病原真菌表現出顯著的抗真菌活性。岑婉瑩等（2016）研究了野生紅貝俄氏孔菌精油化學成分，發現該精油具有一定的抗氧化活性。[本研究切人點]迄今為止，尚未見關于野生和人工培養紅貝俄氏孔菌化學成分及抑菌活性對比分析的研究報道。[擬解決的關鍵問題]分別用葡萄糖酵母膏蛋白胨培養基（GYP）和綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（CPDA）對紅貝俄氏孔菌進行人工培養，通過氣相色譜一質譜聯用技術（GC-MS）對比分析野生菌子實體、人工培養菌絲和培養液3種材料的乙酸乙酯提取物的化學成分，并采用肉湯微量稀釋培養法評價各提取物的體外抑菌活性，考察人工培養對紅貝俄氏孔菌化學成分和抑菌活性的影響，旨在為紅貝俄氏孔菌人工培養物的開發利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

野生紅貝俄氏孔菌子實體于2015年6月采自廣東省佛山市南海區體育公園。通過組織分離法從新鮮野生菌子實體分離獲得純菌種。純菌種用CPDA培養基（去皮馬鈴薯200 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，KH2PO4 3 g，MgS04 1.5 g，維生素B1 10mg，水1000 mL，pH 6.0）培養，保存于4℃冰箱。分析純乙酸乙酯購自廣州市番禺力強化工廠。主要儀器設備：RV8型旋轉蒸發儀（德國IKA公司），氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）（型號7890A-5975C，美國安捷倫科技公司）。

1.2試驗方法

1.2.1茵絲培養 將GYP培養基（葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏2 g，KHzP04 1 g，水1000 mL，pH6.0）和CPDA培養基分別裝入1000 mL三角瓶中，每種培養基各2瓶，每瓶300 mL。0.15 MPa滅菌30 min，冷卻后通過無菌操作將菌種分別接種到三角瓶中，室溫靜置培養45 d。

1.2.2有效成分提取 培養物用紗布過濾，得菌絲體和培養液。菌絲體風干后用100 mL甲醇室溫浸泡提取3次，每次24 h。合并甲醇提取液，合并液于50℃通過真空旋轉蒸發，得到菌絲體浸膏。浸膏用乙酸乙酯溶解，硅膠短柱過濾，用乙酸乙酯充分洗脫。乙酸乙酯洗脫液于50℃下真空旋轉蒸發，回收溶劑后剩余的洗脫物即為菌絲提取物，源于GYP培養基的菌絲提取物記為JSGYP，源于CPDA培養基的菌絲提取物記為JSCPDA。野生菌子實體按相同方法提取，得提取物記為FBWILD。

培養液分別用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后在50℃下真空旋轉蒸發，回收乙酸乙酯后，得到培養液粗提物。粗提物用乙酸乙酯溶解，硅膠短柱過濾，用乙酸乙酯充分洗脫，乙酸乙酯洗脫液合并后在50℃下真空旋轉蒸發，回收溶劑，剩余的洗脫物即為紅貝俄氏孔菌培養液提取物，其中源于GYP培養基的培養液提取物記為FLGYP，源于CP-DA培養基的培養液提取物記為FLCPDA。

1.2.3 GC-MS分析 樣品溶液：分別取一定量FBWILD、JSGYP、JSCPDA、FLGYP和FLCPDA共5種提取物，用乙酸乙酯溶解并配制成1 mg/mL樣品溶液。采用GC-MS分析樣品溶液化學成分。色譜條件：色譜柱采用J&w 122-0132DB-1ms石英毛細管柱（30 m×250um×0.25 Bm）；升溫程序：起始溫度65℃，恒溫4 min，然后以40℃/min速度升溫至280℃，恒溫5 min；溶劑延遲：6.8 min；進樣口溫度：260℃，進樣量1uL；載氣為氦氣。質譜條件：EI離子源，離子源溫度220℃，電子能量70 eV，掃描范圍50-550 m/z。定性定量方法：峰面積歸一法。質譜數據庫：美國NIST08.L譜庫。

1.2.4體外抑茵活性試驗 采用CLSI（2012）介紹的微量稀釋培養法測定紅貝俄氏孔菌5種提取物FBWILD、JSGYP、JSCPDA、FLGYP和FLCPDA體外對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）和大腸桿菌（Escherichia coli）的抑制作用，以獸用鏈霉素和青霉素為對照。操作步驟：（1）制作供試菌菌懸液：將供試細菌接種于M-H肉湯培養基中，于室溫下靜置培養18-24 h，獲得細菌懸液，用M-H肉湯培養基將細菌懸液稀釋成106 CFU/mL接種液。（2）配制抑菌藥液：用二甲基亞砜溶液分別將5種紅貝俄氏孑L菌提取物和對照藥品溶解并配制成起始濃度為12.80 mg/mL的藥液（參照物初始濃度為1.28 mg/mL），用針頭濾器濾菌備用。（3）96微孔板的準備：選用無菌96微孑L板，外圍孔中加200uL無菌水，其余孔中加100uL M-H肉湯培養基；將濾菌后的藥液100uL加到各行的第1孔中，用移液槍吸打混勻，再將稀釋后的藥液100uL移入第2孔中，如此反復，對藥液進行倍半稀釋，使不同孔中藥液濃度范圍為6.40-0.025 mg/mL；最后向每一檢測孔中均加入接種液100uL。（4）抑菌培養：將培養板置于36 ℃孵育18 h，再向每孔加入20uL對碘硝基四唑紫（INT），繼續孵育1 h，觀察孔內溶液的顏色變化，粉紅色的板孔為陽性生長，最低抑菌濃度（MIC）定義為阻止顏色變為粉紅色的最低藥物濃度。試驗重復3次。

2結果與分析

2.1紅貝俄氏孔菌野生子實體和培養菌絲化學成分對比分析結果

從3.38 g風干野生菌子實體得到膏狀提取物FBWILD 0.11 g，提取率為3.25%；從600 mL GYP培養基獲得的2.88 g風干菌絲體得到膏狀提取物JSG-YP 0.14 g，提取率為4.86%；從600 mL CPDA培養基獲得的2.96 g風干菌絲體得到膏狀提取物JSCPDA0.14 g，提取率為4.73%。

采用GC-MS分析FBWILD、JSGYP和JSCPDA的化學成分得到總離子流色譜圖（圖1）。從FBWILD分離獲得59個組分，通過NIST08.L譜庫檢索，共檢出13種化學成分，占總油量的74.943%，其主要成分分別為亞油酸甲酯（18.522%）、棕櫚酸甲酯（15.976%）、棕櫚酸（11.164%）、油酸（7.660%）和苯甲酸（5.330%）；從JSGYP分離獲得50個組分，通過NIST08.L譜庫檢索，共檢出13種化學成分，占總油量的74.886%，其主要成分分別為棕櫚酸（28.677%）、油酸（15.108%）、棕櫚酸甲酯（8.983%）、硬脂酸（6.626%）和油酸甲酯（4.160%）；從JSCPDA分離獲得61個組分，通過NIST08.L譜庫檢索，共檢出14種化學成分，占總油量的65.131%，其主要成分分別為棕櫚酸甲酯（22.575%）、棕櫚酸（17.643%）、硬脂酸甲酯（4.787%）、硬脂酸（4.277%）和油酸（3.861%）（表1）。

由圖1和表1可知，FBWILD、JSGYP和JSCPDA的化學組成不完全相同，但大多數化學成分相同，只是含量發生了變化，如棕櫚酸在野生菌中含量為11.164%，在GYP培養菌絲中含量為28.677%，在CPDA培養菌絲中含量為17.643%。分析已鑒定出的化學成分發現，在3種樣品中均檢測到十五碳酸甲酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸、珠光脂酸甲酯、亞油酸甲酯、油酸和硬脂酸等7種化合物，其中棕櫚酸甲酯、棕櫚酸和油酸是3種樣品共同的主要成分；十五碳酸只存在于FBWILD和JSGYP中，2-十一烷酮、油酸甲酯和（10反，12順）-十八碳二烯酸甲酯只存在于人工培養菌絲中；苯甲酸、9-甲基肉豆蔻酸甲酯和珠光脂酸只在野生菌子實體中檢測到，2-羥基硬脂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯只在JSCPDA中檢測到，十九碳烷和二十八碳烷僅在JSGYP中檢測到。

2.2紅貝俄氏孔菌培養液化學成分對比分析結果

采用GYP和CPDA兩種培養基對紅貝俄氏孔菌進行人工培養。從600 mL GYP培養液獲得的1.66 g粗提物中得到膏狀洗脫物FLGYP 0.44 g，產量0.73mg/mL。從600 mL CPDA培養液獲得的1.34 g粗提物中得到洗脫物FLGYP 0.37 g，產量0.62 mg/mL。

用GC-MS分析FLGYP和FLCPDA的化學成分得到總離子流色譜圖（圖2）。從FLGYP分離獲得68個組分，通過NIST08.L譜庫檢索，共檢出9種化學成分，占總油量的14.361%，其中含量較高的成分依次為十八甲基環壬硅氧烷（4.663%）、1-十九碳烯（2.423%）、（E）-3-十八碳烯（1.785%）、棕櫚酸甲酯（1.642%）和十八烷基2，2，2-三氯乙基碳酸酯（1.546%）；從FLCPDA分離獲得63個組分，通過NIST08.L譜庫檢索，共檢出14種化學成分，占總油量的47.485%，其主要成分分別為棕櫚酸（12.913%）、（Z，E）-2，13-十八碳二烯-1-醇（5.985%）、棕櫚酸甲酯（5.591%）、亞油酸甲酯（4.492%）和1-十九碳烯（3.420%）（表2）。

由圖2和表2可知，FLGYP和FLCPDA的化學組成有明顯差異。FLGYP的化學成分更豐富，有68個組分，而FLCPDA只有63個組分。分析已鑒定出的化學成分發現，在FLGYP和FLCPDA中均檢測到棕櫚酸甲酯、棕櫚酸、棕櫚酸乙酯、1-十九碳烯、十八烷基2，2，2-三氯乙基碳酸酯和2，4-二（1-甲基-1-苯基乙基）苯酚，但含量發生了變化，如棕櫚酸在GYP培養中含量為0.322%，而在CPDA培養液中為12.913%；（E）-3-十八碳烯、十八甲基環壬硅氧烷和（E）-1，3，3-三甲基-2-（3-甲基-2-亞甲基-3-丁烯叉）環己醇只存在于FLGYP中；十七碳烷、十五碳酸甲酯、3，5-二叔丁基-4-羥基苯丙酸甲酯、亞油酸甲酯、亞油酸、（Z，E）-2，13-十八碳二烯-1-醇、7，11-十六碳二烯醛和1-二十四碳醇只在FLCPDA中檢測到。

2.3體外抑菌活性測定結果

紅貝俄氏孔菌5種不同提取物體外對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性測定結果（表3）表明，5個樣品均有一定的抑菌活性，其中FLGYP的抑菌活性最強，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.80 mg/mL，其余樣品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均為1.60 mg/mL。

3討論

高等真菌的生長及其化學成分受碳源、氮源等因素的影響（譚琪明，2014；楊培新等，2015），獲得高等真菌產活性物質的最佳培養條件是馴化野生真菌的關鍵，而GC-MS在易揮發化學成分分析中應用廣泛（岑婉瑩等，2016），因此采用GC—MS可快速準確地分析不同培養基下紅貝俄氏孔菌子實體和培養液易揮發化學成分。

本研究通過GYP和CPDA兩種培養基對野生紅貝俄氏孔菌菌絲進行人工培養，結果該菌在供試兩種培養基中長勢良好，從600 mL GYP培養基中獲得風干菌絲2.88 g，產量4.80 mg/mL，從600 mL CPDA培養基中獲得風干菌絲2.96 g，產量4.93 mg/mL。另外，從人工培養菌絲獲得的洗脫物獲得率分別為4.86%（JSGYP）和4.73%（JSCPDA），均高于從野生菌子實體獲得的洗脫物FBWILD獲得率（3.25%），特別是從培養液中還獲得了該菌的次級代謝粗提物，從600 mL GYP培養液獲得粗提物1.66 g，產量2.77mg/mL，從600 mL CPDA培養液中獲得粗提物1.34 g，產量2.23 mg/mL。

GC-MS分析結果表明，人工培養菌絲和野生菌子實體的化學組成不完全相同，而且含量發生了明顯變化。如棕櫚酸甲酯在野生菌子實體中的含量為15.976%，但在人工培養菌絲中的含量分別為8.983%（GYP培養基）和22.575%（CPDA培養基）。一些存在于野生菌子實體中的化學成分如苯甲酸在人工培養菌絲中未能發現，但在人工培養菌絲中發現了野生菌子實體不存在的化學成分，特別是從人工培養液中獲得了豐富的次級代謝產物，大部分次級代謝產物在野生菌子實體或人工培養菌絲中均未得到。對FLGYP和FLCPDA的GC-MS分析表結果明，培養基不同，其次級代謝產物也不完全相同。本研究通過GC-MS只鑒定出了供試5個洗脫物中的少數化學成分，大多數化學成分未能得到鑒定，仍需要進一步通過分離純化，結合NMR等技術加以解析。

體外抑菌試驗結果表明，紅貝俄氏孔菌不同提取物FBWILD、JSGYP、JSCPDA、FLGYP和FLCPDA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑菌活性，其中FLGYP的抑菌活性最強，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.80 mg/mL，其余樣品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均為1.60 mg/mL，說明這些樣品中可能含有相同的抑菌活性成分，但FLGYP對金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強，說明FLGYP中可能還含有其他抑菌活性成分。

由于GC-MS只能通過與NIST譜庫中已知化合物質譜數據對比以鑒定樣品中的化合物，對于樣品中含有但NIST譜庫中未記錄的化合物尚未能得到鑒定。同時，樣品中的高沸點化合物也不能通過GC-MS進行鑒定。因此，紅貝俄氏孔菌中可能存在其他未知的抗菌活性成分，有待通過規模培養，采用現代分離純化技術獲得足夠量的單體化合物，然后進一步通過核磁共振波譜、高分辨質譜等技術加以結構解析。

4結論

運用GC-MS分析紅貝俄氏孔菌野生菌子實體、人工培養菌絲體和培養液乙酸乙酯提取物的化學成分，并通過NIST08.L譜庫檢索鑒定樣品中的化合物，結果表明，GYP和CPDA培養獲得的菌絲體與野生菌子實體的化學組成不完全相同，主要成分均為棕櫚酸、棕櫚酸甲酯和油酸等，但含量存在差異；從人工培養獲得的培養液中可獲得豐富的次級代謝產物，主要成分均為棕櫚酸甲酯和棕櫚酸，但在不同培養條件下各培養液中的次級代謝產物存在差異。體外抑菌活性試驗結果表明，紅貝俄氏孔菌人工培養菌絲提取物及野生菌子實體提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現出抑制活性。因此，可采用GYP和CPDA為培養基對野生紅貝俄氏孔菌進行規模培養，以解決野生紅貝俄氏孔菌資源不足的問題。