運輸脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟、鰓和脾臟組織結構的影響

劉奇奇　溫久福　區又君　李加兒　周慧

摘要：[目的]探究運輸脅迫對四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）幼魚肝臟、鰓、脾臟組織結構的影響，提高種苗運輸存活率，為其規模化養殖提供技術支持。[方法]以四指馬鲅幼魚為研究對象，分別設對照組（未運輸）、混合組（運輸，同時添加抗應激混合物）和空白組（運輸，不添加任何抗應激劑），抗應激劑為維生素c：谷氨酰胺=1：1。混合組和空白組幼魚經6 h運輸后分別取樣（肝臟、鰓和脾臟），經石蠟切片和HE染色，顯微鏡下觀察測定肝臟、鰓和脾臟的細胞形態、組織結構、生活及生理狀態。[結果]對照組幼魚表現正常，未出現死亡現象，混合組幼魚的累計死亡率為12.5%，空白組的累計死亡達27.5%。對照組幼魚的各組織均呈正常形態；混合組幼魚的肝臟部分區域細胞排列疏松，肝小板結構不清晰；空白組幼魚的肝臟組織整體失去固有形態，肝小板結構消失不見，大部分細胞核變性呈橢圓形或紡錘形。混合組幼魚的鰓絲排列混亂，少數鰓小片末端或整體腫脹，血竇內紅細胞出現部分堆積現象，線粒體豐富細胞體積變大；空白組的鰓小片整體腫脹，血竇加粗，部分鰓小片因紅細胞過多而脹破，線粒體豐富細胞體積變大且數量增多。混合組幼魚的脾臟白髓區域相對增大，黑色素-巨噬細胞中心數量及大小均有所增加；空白組幼魚的脾臟組織紅髓區域占據大部分，白髓區域相對較少，呈零散分布，巨噬細胞中心減小。[結論]運輸脅迫導致四指馬鲅幼魚肝臟、鰓及脾臟組織損傷，抗應激劑混合物雖然在一定程度上起到緩解作用，但并不能完全消除。

關鍵詞：四指馬鲅；運輸脅迫；肝臟；鰓；脾臟；組織損傷；抗應激劑

0引言

[研究意義]四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）俗稱午魚、馬友等，隸屬于鯔形目（Mugiliformes）馬鲅科（Polynemidae）四指馬鲅屬（Eleutheronema）（孫典榮和陳錚，2013），因具有肉質鮮美、抗病力強、生長迅速等優點而深受廣大養殖戶青睞，現已發展成為新興水產養殖品種之一。隨著四指馬鲅人工繁育技術的攻克，目前在我國臺灣、廣東、海南、浙江等地已有人工養殖（謝木嬌等，2016a），且養殖規模和市場占有率逐年擴大，但四指馬鲅抗應激能力較弱，尤其種苗極易受運輸等人為活動的影響，是制約四指馬鲅規模化養殖的重要因素。因此，加強四指馬鲅種苗抗應激能力研究，解決長途運輸種苗存活率的問題，對促進其養殖業的健康快速發展具有重要意義。[前人研究進展]至今，有關四指馬鲅的研究已有較多報道，包括不同發育階段消化道組織學比較（謝木嬌等，2016b）、受精卵和仔魚對不同鹽度的耐受性（謝木嬌等，2016c）及消化道黏液細胞的發育規律（謝木嬌等，2015；謝木嬌等，2016a）等。此外，Zischke等（2009）、Moore等（2011）以寄生蟲的種群結構推測寄主遺傳結構，系統分析了澳大利亞東部及北部四指馬鲅的遺傳結構；Newman等（2011）、Ballagh等（2012）分別以同位素標記及生活史特征研究澳大利亞北部四指馬鲅的種群結構；林少珍等（2012）利用COI基因序列對我國東南沿海四指馬鲅種群的遺傳結構進行分析；羅海忠等（2015）采用鹽度漸變法研究5種鹽度對四指馬鲅幼魚生長及其鰓絲Na+/K+-ATP酶的影響。上述研究結果為四指馬鲅的養殖生產提供了科學依據。[本研究切入點]應激是機體對外界或內部各種異常刺激所產生的非特異性全身反應，是生物體在長期進化中形成的一種適應性和防御性功能。魚類極易受水環境及其他外界環境的影響從而產生應激反應，對其健康造成不利影響，尤其是長期應激脅迫會降低機體的抵抗力和生長速率等（孫鵬等，2014），但目前有關環境脅迫影響四指馬鲅的研究鮮見報道。[擬解決的關鍵問題]通過對比運輸脅迫前后四指馬鲅幼魚肝臟、鰓及脾臟的顯微結構變化，探究四指馬鲅應對運輸脅迫的應答規律，旨在提高種苗運輸存活率，為其規模化養殖提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試四指馬鲅幼魚于2016年6-9月在南海水產研究所珠海試驗基地培育獲得，體長11.0±0.5 cm，體質量24.0±1.5 g。試驗開始前進行馴養，使其適應環境，期間每天換水1次，每次換水量1/2左右，連續充氣增氧。馴養1周后隨機挑選90尾體色正常、健康的幼魚用于試驗。

1.2試驗方法

在水溫25℃、pH 8.0±0.2、溶解氧6.0±0.5 mg/L的條件下，將四指馬鲅幼魚隨機平均分為3組，即對照組（未運輸）、混合組（運輸，同時添加抗應激混合物）和空白組（運輸，不添加任何抗應激劑）。對照組幼魚（30尾）用MS-222麻醉2-3 min，取其肝臟、鰓和脾臟樣品固定于4%多聚甲醛溶液中。同時取6個相同規格的暫養桶（直徑1.3 m、高1.5 m，加水量約占總體積的80%），其中3個暫養桶（混合組）參考周傳朋等（2014）的方法在養殖水中添加維生素C：谷氨酰胺=1：1的抗應激劑混合物，使其濃度為20 mg/m3；另外3個暫養桶（空白組）的養殖水不添加抗應激劑。每個桶暫養10尾四指馬鲅幼魚，以中型卡車在公路上正常行駛6 h。運輸結束時，以同樣方法取肝臟、鰓和脾臟樣品，固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.3測定項目及方法

參照陳世喜等（2017）的方法，取出4%多聚甲醛固定的四指馬鲅幼魚肝臟、鰓和脾臟樣品，經流水沖洗、70%-100%乙醇脫水和二甲苯透明，以石蠟包埋處理后用Leica切片機進行連續切片，切片厚度5-6pm，采用HE染色和中性樹脂封片，于Zeiss顯微鏡下觀察拍照。觀察測定項目包括幼魚肝臟、鰓和脾臟的細胞形態、組織結構及其生活生理狀態。

2結果與分析

2.1運輸脅迫前后四指馬鲅幼魚的生活狀態及死亡率

對照組幼魚表現正常，沿暫養池壁集體朝同一方向不停游動，未出現死亡現象；混合組幼魚在運輸期間向不同方向快速、混亂游動，并撞擊桶壁，有少數幼魚死亡，累計死亡率為12.5%；空白組幼魚在運輸初期與混合組無明顯區別，但隨著運輸時間的延長，幼魚游動速度明顯減慢，且動作不協調，有的甚至呈側游或翻身游動，運輸結束后的累計死亡率達27.5%。

2.2運輸脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟組織的影響

對照組幼魚的肝細胞呈多面體緊密排列，細胞核大而圓，多為單核，居細胞中央，且著色較深，部分細胞出現因糖原溶解形成的空泡；肝小板和肝血竇沿中央靜脈呈放射狀相間排列，結構清晰；中央靜脈位于肝小葉中部，周圍有許多肝血竇開口，其橫切面呈圓形，均表現為正常形態（圖1-1、圖1-2和圖1-3）。混合組幼魚的肝臟受到較輕微損傷，主要表現為肝細胞空泡消失，形狀不規則，部分區域細胞排列散亂，部分細胞核著色較深；肝小葉及肝小板結構不清晰，肝血竇間隙增大；中央靜脈橫切面呈不規則形狀（圖1-4、圖1-5和圖1-6）。空白組幼魚的肝組織受到嚴重損傷，主要表現為整體肝細胞核失去固有形態，細胞排列松散且不規則，大部分細胞核變性呈橢圓形或紡錘形，著色較淺，空泡消失；肝小板及肝小葉結構消失不見；中央靜脈周圍肝血竇開口較大，其橫切面呈不規則形狀且內部充滿血細胞（圖1-7、圖1-8和圖1-9）。

2.3運輸脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織的影響

對照組幼魚鰓組織中線粒體豐富細胞呈橢圓形，分布在鰓小片基部，上皮細胞呈扁平狀規則排列；血竇內均勻分布有紅細胞，兩側的鰓小片對稱且完整，鰓絲密集且排列整齊，其結構表現為正常的生理形態（圖2-1、圖2-2和圖2-3）。與對照組相比，混合組幼魚鰓組織中線粒體豐富細胞體積變大；血竇收縮，其紅細胞分布不均勻，出現部分堆積現象；鰓小片呈S形扭曲且排列不規則，大部分鰓小片彎曲，少數鰓小片末端或整體腫脹；鰓絲排列不整齊，部分鰓絲中間開裂，且著色力減弱（圖2-4、圖2-5和圖2-6），表明運輸脅迫對鰓組織已造成一定損傷，但并不嚴重。空白組幼魚鰓組織中線粒體豐富細胞體積變大且數量增多，大部分上皮細胞水腫變性，部分表皮出現脫落現象；鰓小片整體腫脹，血竇增寬，紅細胞分布不均勻，部分鰓小片因紅細胞過多而脹破；鰓絲整體水腫，部分鰓絲中間開裂，其整體偏離正常形態（圖2-7、圖2-8和圖2-9），表明運輸脅迫對鰓組織造成嚴重損傷。

2.4運輸脅迫對四指馬鲅幼魚脾臟組織的影響

對照組幼魚脾臟組織網狀支架上分布極密集的淋巴細胞，最外層可觀察到被膜，局部可見由被膜結締組織形成的小梁結構；被膜以下由紅髓和白髓交替分布形成密集網狀結構的脾臟實質，分布有大量的淋巴細胞和巨噬細胞；在紅髓周圍稀散分布的為白髓結構，區域面積相對紅髓區域要小很多，內部分布有密集的淋巴細胞（圖3-1、圖3-2和圖3-3）。與對照組相比，混合組幼魚的脾臟組織受到一定損傷，但并不嚴重，表現為白髓區域增大，黑色素一巨噬細胞中心數量及大小均有所增加；邊緣區面積增加（圖3-4、圖3-5和圖3-6）。空白組幼魚脾臟嚴重損傷，表現為組織中充滿紅細胞，紅髓與白髓相對較少，呈零散分布，巨噬細胞中心數量和邊緣區域面積均減小（圖3-7、圖3-8和圖3-9）。

3討論

與自然條件下相比，魚類在集約化養殖過程中需經受更多人為因素的干擾，但在長期進化過程中魚類已形成了相應的調節機制。劉小玲（2007）研究表明，輕度刺激可促進魚類生長，改善魚類體質，但劇烈或長期刺激會干擾魚類的正常生理功能，導致機體功能紊亂，甚至死亡。肝臟是魚類最大的消化腺，可分泌膽汁促進脂肪的分解與吸收，又參與多種物質的合成、儲存、代謝和轉化。肝細胞內含有多種內含物，主要有糖原、脂滴及色素等，且其含量與機體的生理狀態密切相關。彭士明等（2011）研究表明，運輸脅迫下銀鯧（Pampus argenteus）的機體能量供給主要來自肝臟糖元分解。本研究中，由于分組過程中幼魚受到驚嚇，導致其肝糖元的代謝與合成平衡被打亂，可能是對照組四指馬鲅幼魚肝臟組織出現空泡的原因。Johnston等（1989）對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的研究表明，維生素C可通過神經調節因子調節腦部激素水平，調控魚類行為以增強其抗應激能力。黃玉萍等（2010）研究表明，抗應激復合物可有效提高團頭魴（Megalobrama amblycephala）的抗應激能力，降低應激對肝臟等組織的損傷。此外，徐洋等（2011）研究證實谷氨酰胺可促進腸道黏膜修復、淋巴細胞增殖、巨噬細胞分裂和分化，在免疫調節方面具有重要意義。本研究中，混合組幼魚肝細胞空泡消失可能是抗應激劑對魚類能量代謝起調解作用。運輸過程中幼魚因受到驚嚇而劇烈掙扎游動，其能量代謝及耗氧量隨之增加，為滿足機體對氧的需求，故肝血竇間隙增大、血流加快；部分肝細胞排列散亂及不規則的中央靜脈橫切面，其原因可能是運輸過程中幼魚不斷撞擊桶壁導致肝臟組織發生機械性損傷。四指馬鲅幼魚的肝臟組織在運輸脅迫后失去固有形態，其生理狀態趨于崩潰，累計死亡率高達27.5%，與Zhang等（2004）的研究結果相似。總之，運輸脅迫會對四指馬鲅幼魚的肝臟造成損傷，添加抗應激劑混合物可起到一定的緩解作用，但無法從根本上消除。

鰓是魚類的主要呼吸器官，同時具有排泄氨氮等代謝廢物及調解滲透壓的功能。本研究中，混合組幼魚鰓線粒體豐富細胞體積變大的現象與高鹽度下卵形鯧夠（Trachinotus ovatus）線粒體豐富細胞（區又君等，2013）的變化相同，表明運輸應激破壞了四指馬鲅幼魚的滲透壓平衡，少數鰓小片末端或整體出現腫脹現象。與肝組織相同，在抗應激劑混合物作用下四指馬鲅幼魚的鰓基礎代謝增加、血流加快，但由于運輸脅迫致使血竇收縮，從而導致紅細胞分布不均勻，出現部分堆積現象，與陳彩芳等（2012）對泥蚶（Tegillarca granosa）的研究結果相似。本研究中，混合組幼魚鰓小片呈S形扭曲且排列不規則，可能是運輸過程中幼魚劇烈掙扎，加上滲透壓遭到破壞，鰓小片局部吸水所造成。空白組幼魚線粒體豐富細胞體積變大且數量增多，與鹽度脅迫遮目魚（Chanos chanos）幼魚的試驗結果（區又君等，2014）相似，表明四指馬鲅幼魚為克服運輸脅迫，調動相關生理反應而消耗大量能量。四指馬鲅幼魚鰓組織上皮細胞水腫變性，部分表皮脫落，表明運輸脅迫導致鰓Na+/K+-ATP酶活性下降，即在無抗應激劑的條件下幼魚鰓功能遭到破壞。可見，運輸脅迫致使四指馬鲅幼魚鰓組織出現不同程度的損傷，添加抗應激劑能起到明顯的緩解作用。

脾臟主要由淋巴組成，在魚類的造血、免疫及儲血方面發揮著重要作用。低鹽脅迫下，許氏平觸（Sebastes schlegeli）脾臟組織中淋巴細胞數量增多，且呈聚集現象（王曉杰等，2006）。本研究中，混合組幼魚脾臟組織的變化與低鹽脅迫下許氏平觸脾臟組織的變化相似，表明抗應激劑在一定程度上能提高受運輸脅迫幼魚的免疫反應能力，促使免疫細胞的數量合成增加。王文博等（2004）對草魚（Ctenopharyngodon idellus）的研究表明，擁擠脅迫會對魚類脾臟器官造成極大損傷。運輸脅迫下四指馬鲅幼魚脾臟組織的白髓及巨噬細胞中心數量均相對減少，說明其免疫系統已無法抵御運輸脅迫的干擾，免疫細胞合成受阻，與王曉杰等（2006）的研究結果相似，表明長期處于應激脅迫下魚類免疫力易受到明顯影響，因此在養殖生產過程中應避免長期的逆境脅迫。

實際生產中，采取以下措施能有效提高魚類的抗應激能力（王慶萍等，2013）：（1）運輸過程中應避免多重應激；（2）盡量縮短運輸時間；（3）避免在高溫季節運輸；（4）長途運輸前宜禁食2-3 d，以減少應激時的耗氧量；（5）可在餌料中適當添加維生素C、谷氨酰胺等抗應激劑。此外，Verbeek等（2008）研究證實，魚類的早期應激經歷可增強其后期抗應激的適應能力，即通過適當馴化可有效提高魚類的抗應激能力；鄺哲師等（2011）、Bacarin等（2015）研究表明，餌料中添加乳酸菌、不飽和脂肪酸或魚油等也可改善魚類體質，提高其抗應激能力。因此，在餌料中適量添加益生菌或不飽和脂肪酸等，可能是提高四指馬鲅運輸存活率的有效途徑之一。

4結論

運輸脅迫導致四指馬鲅幼魚肝臟、鰓及脾臟組織損傷，抗應激劑混合物雖然在一定程度上起到緩解作用，但并不能完全消除。