巴西橡膠樹生長(zhǎng)素響應(yīng)HbJAR1基因克隆與表達(dá)分析

李曉娜 肖厚貞 萬三連 張冬 張宇

摘 要 JAR1基因是植物生長(zhǎng)素響應(yīng)基因，具有維持植物體內(nèi)生長(zhǎng)素濃度動(dòng)態(tài)平衡和增強(qiáng)植物抗逆性的功能。為了闡明巴西橡膠樹中JAR1基因的結(jié)構(gòu)與功能，本研究利用Q-PCR 技術(shù)在橡膠樹CATAS7-33-97葉片中擴(kuò)增了JAR1基因，其推導(dǎo)氨基酸含有JAR1蛋白特征性的GH3 superfamily結(jié)構(gòu)域，無信號(hào)肽，無跨膜區(qū)域，定位在細(xì)胞質(zhì)中，命名為HbJAR1。表達(dá)分析結(jié)果表明：該基因在橡膠樹葉片中的表達(dá)量受光照強(qiáng)度、機(jī)械傷害和白粉菌侵染顯著上調(diào)，吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脫落酸（ABA）和赤霉素（GA3）對(duì)HbJAR1在橡膠樹中的表達(dá)也起到不同程度的上調(diào)作用。表明HbJAR1基因?qū)儆谥参颙AR1家族，與橡膠樹對(duì)光照、傷害等逆境響應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；HbJAR1；基因克隆；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Gene Cloning and Expression Analysis of Auxin

Responsive HbJAR1 in Rubber Tree

LI Xiaona1， XIAO Houzhen3， WAN Sanlian4， ZHANG Dong2， ZHANG Yu2 *

1 Institute of Scientific and Technical Information， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China

2 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bio-resources / College of Tropical Agriculture

and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Materials and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

4 Sanya City Modern Agricultural Inspection and Warning Center for the Prevention and Control， Sanya， Hainan 572000， China

Abstract JAR1， a auxin response gene， maintains dynamic balance of auxin concentration in plant， strengthens plant tolerance ability stress. To clarify the gene structure and function of JAR1 in rubber tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）， HbJAR1 gene was cloned in the leaves of rubber tree CATAS7-33-97 by RT-PCR. The deduced amino acid of HbJAR1 protein has special GH3 superfamily domain structure， no signal peptide， no transmembrane region， located in the cytoplasm. The gene expression of HbJAR1 in the leaves of rubber tree was significantly affected by light intensity， mechanical wounding and powdery mildew infection. IAA， GA3， ET， JA and ABA treatments also induced HbJAR1 expression at different levels. The results suggested that HbJAR1 is a member of plant JAR1 gene family， involved in stress response such as light and wounding signal in rubber tree， etc.

Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.； HbJAR1； gene clone； bioinformatics； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.017

JAR1（JASMONATE RESISTANT 1）基因是植物生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因之一，這類基因與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[1]。JAR1基因最先在大豆中發(fā)現(xiàn)，隨后又陸續(xù)在大豆、擬南芥、水稻、葡萄、桃、高粱、桑樹、白楊以及苜蓿等多種植物中發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的JAR1基因[1-4]。到目前為止，模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)20個(gè)JAR1基因，編碼蛋白的分子量大約65～70 ku，其蛋白的氨基或羧基端有保守的CC結(jié)構(gòu)域（Coiled-coil domains）[5]。JAR1基因在植物生長(zhǎng)素信號(hào)途徑、光信號(hào)途徑以及植物的防衛(wèi)反應(yīng)中都起著重要的作用。擬南芥JAR1蛋白具有一種或多種植物生長(zhǎng)素的氨基酸合成酶活性[2]。除了擬南芥具有這一功能外，其他植物中的JAR1蛋白也被陸續(xù)證明具有此類功能。同時(shí)，擬南芥JAR1蛋白在維持植物生長(zhǎng)素動(dòng)態(tài)平衡以及光信號(hào)傳導(dǎo)途徑的過程中也具有重要的作用[6]，還參與茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）介導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)。但該功能的研究目前主要集中在擬南芥的少數(shù)幾個(gè)JAR1基因中[5]。

橡膠樹作為生產(chǎn)天然橡膠的最主要來源。在中國(guó)非傳統(tǒng)植膠區(qū)，橡膠樹生長(zhǎng)和乳膠產(chǎn)量會(huì)在不同程度上受到割膠、白粉菌等環(huán)境條件的影響。例如，干旱導(dǎo)致了橡膠樹病蟲害發(fā)生率和死皮率的增加，還增加了災(zāi)害預(yù)報(bào)和管理的成本[7-8]，降低了橡膠樹膠乳產(chǎn)量[9]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致橡膠樹植株死亡[10]。白粉病作為橡膠樹的重要病害之一，會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11]。盡管植物JAR1基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆機(jī)制具有重要作用，但在橡膠樹中研究甚少。本研究克隆了橡膠樹葉片中的JAR1基因，研究其結(jié)構(gòu)和功能，為闡明其在橡膠樹抗病等逆境響應(yīng)中的作用打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院教學(xué)基地巴西橡膠樹品種熱研7-33-97葉片作為試驗(yàn)材料，提取總RNA。選取頂篷葉片處于穩(wěn)定期且2蓬葉均勻一致的熱研7-33-97芽接苗進(jìn)行光照強(qiáng)度、機(jī)械傷害、白粉菌侵染和5種激素[吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）]處理[12]。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取以及cDNA的合成 橡膠樹膠乳和不同處理下葉片總RNA的提取方法參照Qin等[12-13]，RNA中殘留的少量的DNA利用DNase I去除，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所得RNA的OD230、OD260、OD280吸收值和OD260/OD230、OD260/OD280的比值，并計(jì)算總RNA濃度及其純度。同時(shí)RNA的完整性檢測(cè)采用1%甲醛變性膠電泳進(jìn)行。利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書進(jìn)行cDNA合成。

1.2.2 橡膠樹膠乳JAR1部分序列的EST克隆

根據(jù)NCBI搜索的EST序列，采用primer 6.0軟件設(shè)計(jì)基因特異引物HbJAR1-F1（5′-CAATGTGG

CGTATGTTAGAA-3′）和HbJAR1-R1（5′-ATTACTGC

GGTAGGTCTTG-3′），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行巴西橡膠樹JAR1基因的cDNA序列擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增使用2×Taq PCR Master Mix（天根生化），反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，凝膠回收純化，并克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，送測(cè)序[14]。

1.2.3 巴西橡膠樹JAR1基因結(jié)構(gòu)分析 序列比對(duì)采用DNAMAN6.0軟件，ORF篩選采用DNAstar軟件，結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI Blastp軟件和PROSITE，理化性質(zhì)分析采用Expasy的ProtParam，采用MEGA6.06軟件通過neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[15]。信號(hào)肽采用SignalP分析[16]，跨膜結(jié)構(gòu)域采用TMpred和TMHMM分析，細(xì)胞定位采用PSORT，Mitoprot和TargetP分析。

1.2.4 巴西橡膠樹JAR1基因表達(dá)分析 白粉菌處理，采用Wang等[17]方法；植物激素處理，將頂端胚芽鞘（10 mm）置于KPSC緩沖液（10 mm磷酸鉀，pH值6.0，2% 蔗糖，50 μmol/L氯霉素）中培養(yǎng)16 h，去除內(nèi)生植物生長(zhǎng)激素，再將其轉(zhuǎn)移到5種處理的激素中，在處理后0、0.5、1、3、6、12、24 h收集樣品；光照處理分別在100、200、400、1 000 μmol/（m2·s）光強(qiáng)下處理，采集不同處理下的葉片，并將它們立即置于-80 ℃冷凍保存。最后用設(shè)計(jì)好的熒光定量引物FHbJAR1F：ACGCAGGTT ACATTAGTTCT，F(xiàn)HbJAR1R：GGTAGGTCTTGGCA ACATT擴(kuò)增，以HbACTIN為內(nèi)參基因，分析HbJAR1的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件。采用Origin2015科技繪圖軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹HbJAR1基因克隆與生物信息學(xué)分析

克隆得到cDNA全長(zhǎng)為1 886 bp，將其命名為HbJAR1（基因登錄號(hào)：JQ060895），5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為46 bp，3′端非編碼區(qū)109 bp，編碼區(qū)1 731 bp，編碼576個(gè)氨基酸（圖1）。分子式為C2 931H4 588N766O868S21，總原子數(shù)9 174，推導(dǎo)的氨基酸理論分子量65.1 ku，等電點(diǎn)5.69。根據(jù)HbJAR1的cDNA序列推導(dǎo)氨基酸序列與其他植物擬南芥AtJAR1-3（Arabidopsis thaliana，O22190.1）、擬南芥AtJAR1-4（Arabidopsis thaliana，Q9LQ68.1）、擬南芥AtJAR1-12（Arabidopsis thaliana，Q9LYU4.1）、擬南芥AtJAR1（Arabidopsis thaliana，Q9SKE2.2）、水稻OsJAR1-5（Oryza sativa，Q6I581.1）、水稻OsJAR1-12（Oryza sativa，Q53P49.1）相似性分別為35.17%、34.72%、34.2%、63.73%、64.16%、50.57%（圖2）。聚類分析結(jié)果表明HbJAR1蛋白與水稻家族成員OsJAR1-5相似度最高，聚為一類（圖3）。

植物的JAR1含有一個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域：JAR1 superfamily[pfam03321]。從圖4的生物信息學(xué)分析可以看出，在圖4-A中HbJAR1蛋白具有特征性JAR1 superfamily結(jié)構(gòu)域（從13位到562位氨基酸具有保守性），并與其他JAR1成員高度保守，屬于JAR1家族成員。根據(jù)TargetP 1.1，Mitoprot和PSORT分析細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，HbJAR1蛋白在細(xì)胞質(zhì)、微體、線粒體基質(zhì)、溶酶體中的幾率分別為0.45、0.3、0.1、0.1，表明HbJAR1主要定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖4-B），無信號(hào)肽和跨膜區(qū)域。

2.2 HbJAR1基因的表達(dá)分析

用不同的光照強(qiáng)度處理橡膠樹芽接苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HbJAR1在200 μmol/（m2·s）光強(qiáng)下的表達(dá)量相對(duì)100 μmol/（m2·s）光強(qiáng)下的降低了一倍，但在400 μmol/（m2·s）光強(qiáng)下表達(dá)量顯著上調(diào)，并達(dá)到最大值（圖5）。說明光照強(qiáng)度會(huì)影響HbJAR1的表達(dá)，該基因與橡膠樹對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)有關(guān)。

從圖6可看出，機(jī)械傷害能上調(diào)HbJAR1在橡膠樹中的表達(dá)。在處理葉片后的1～2 h基因的表達(dá)量達(dá)到最高峰，隨后下降，在10 h時(shí)，又繼續(xù)上調(diào)，說明HbJAR1與橡膠樹對(duì)機(jī)械傷害響應(yīng)有關(guān)。

白粉菌侵染后，不同級(jí)別的葉片中HbJAR1的表達(dá)均顯著上調(diào)，在5、7級(jí)葉片中基因的表達(dá)量上調(diào)到12倍和10倍（圖7）。說明白粉病菌侵染會(huì)導(dǎo)致HbJAR1基因表達(dá)的顯著增加。

用乙烯利處理橡膠樹葉片，發(fā)現(xiàn)在處理后6 h，HbJAR1的表達(dá)量開始出現(xiàn)顯著的上調(diào)現(xiàn)象，而且達(dá)到最高峰，是0 h的1.7倍。茉莉酸處理下HbJAR1的表達(dá)規(guī)律同乙烯利處理一致，也是在6 h出現(xiàn)最高峰，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量整體呈下降趨勢(shì)。而HbJAR1對(duì)脫落酸和赤霉素處理的響應(yīng)速度最快，都是在處理后0.5 h時(shí)便開始出現(xiàn)顯著的上調(diào)現(xiàn)象。所不同的是，在赤霉素處理后的0.5 h，基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，是0 h的30倍；而用脫落酸處理的樣品中，基因的表達(dá)量在處理后10 h達(dá)到最高峰，是0 h的58倍。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，赤霉素和脫落酸處理對(duì)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)是基本一致的（圖8）。用吲哚乙酸處理橡膠樹葉片后，在0～2 h時(shí)HbJAR1表達(dá)量略有下降，到6 h時(shí)，表達(dá)量開始上升，到48 h時(shí)達(dá)到最大值，是0 h的3.7倍（圖9）。HbJAR1基因受多種激素的誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，表明HbJAR1可能在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要的作用。

3 討論

關(guān)于JAR1基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究主要集中在擬南芥等模式植物中。筆者在橡膠樹中發(fā)現(xiàn)HbJAR1基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)的分子量大小為65.1 ku，而擬南芥中大約為65～70 ku。在對(duì)HbJAR1的信號(hào)肽和跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)分析顯示，該蛋白可能不存在信號(hào)肽和跨膜區(qū)域，這與桑樹中MaJAR1.6蛋白相同[3]。辣椒CaJAR1蛋白中也未檢測(cè)到跨膜區(qū)域，該蛋白主要定位在葉綠體內(nèi)[4]，而橡膠樹HbJAR1主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。將橡膠樹中克隆得到JAR1基因與擬南芥和水稻中的該基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與水稻的相似度達(dá)60%以上，并含有特征性結(jié)構(gòu)域。說明HbJAR1是植物JAR1家族成員。

JAR1基因作為植物生長(zhǎng)素響應(yīng)基因，它不但在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生長(zhǎng)素平衡中起著重要的作用，還能響應(yīng)其他植物激素，可以通過編碼一種生長(zhǎng)素-氨基酸結(jié)合酶來調(diào)節(jié)游離植物激素的濃度[18]。所不同的是IAA-amino 的形成造成IAA失活，并抑制生長(zhǎng)素信號(hào)途徑，而JA-amino 的形成卻可以激活JA信號(hào)途徑[1]。目前研究的植物中，擬南芥20個(gè)JAR1蛋白中，絕大部分都具有這一功能[19-20]。本研究中，HbJAR1在受到JA誘導(dǎo)時(shí)，其表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)。在IAA處理后，處理初期，基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，直到處理后6 h開始出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象。Hagen等[21]認(rèn)為在生長(zhǎng)素濃度較低時(shí)JAR1轉(zhuǎn)錄會(huì)受到抑制，并不是所有JAR1基因都能響應(yīng)生長(zhǎng)素的處理而出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄上調(diào)，如經(jīng)生長(zhǎng)素處理的擬南芥AtJAR1.9和17并沒有出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，經(jīng)生長(zhǎng)素處理的水稻OsJAR1.9和11反而出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄水平下降。在GA3和ABA作用下，HbJAR1在處理早期便出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。楊樹中赤霉素GA3能激活生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸從而增加莖干的生長(zhǎng)素水平，生長(zhǎng)素之間還存在交互作用，而JAR1基因在其中是否起著至關(guān)重要的作用尚不明確。JAR1蛋白還參與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過影響植物對(duì)光的吸收來影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[6，20]。同時(shí)，機(jī)械損傷和白粉菌侵染處理都能誘導(dǎo)JAR1基因表達(dá)的上調(diào)。同樣在橡膠樹的研究中，這些逆境因素均能引起HbJAR1的上調(diào)表達(dá)，說明HbJAR1參與橡膠樹的逆境調(diào)控響應(yīng)。

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