肉餅兜蘭葉片生長模型與解剖結構研究

張英杰　初美靜　劉學慶　張京偉　郭文姣　劉述河　孫紀霞

摘 要 以2種肉餅兜蘭為試材，研究其葉片生長發育規律和解剖結構。結果表明：兜蘭葉片生長動態呈現S型生長曲線，生長周期長，葉片壽命長。兜蘭的葉片長度、寬度和葉面積隨苗齡增大而增大，萌發新葉的間隔時間隨苗齡增大而增長，新葉的發育周期隨苗齡增大而增長。兜蘭的表皮細胞厚，而葉肉細胞厚度低，葉片組織結構緊密度低，可能是導致兜蘭雖為C3植物但是營養生長速度慢的原因。兜蘭的葉片厚、上表皮細胞巨大、角質層較厚、氣孔下生型和龍骨狀主葉脈發達，具有明顯的旱生特點。

關鍵詞 兜蘭；葉片；生長曲線；解剖結構

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract The leaf growth model and anatomical structure was analyzed and observed on 2 cultivars of Paphiopedilum pacific. Results showed that the leaf growth dynamics were both“S”-type curve， and the leaf had a long growth cycle and lifetime. Older leaf， longer leaf length led to longer time needed to germinate a new leaf and fully develop. The adaxial epidermis was thick， while the mesophyll cell was thin， so its organizational structure closely degree was low， which might lead to its slow growth， though it belonged to C3 plant. Paphiopedilum pacific had thick leaves， and its adaxial epidermis was big and cuticula was thick， and also， its sunken stomata and developed carinate veins illustrated that Paphiopedilum had an obvious drought characteristic.

Key words Paphiopedilum pacific； leaf； growth curve； anatomical structure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.009

兜蘭屬（Paphiopedilum），是蘭科（Orchidaceae）的一類瀕危植物，暢銷于國際花卉市場，其觀賞價值和經濟價值極高[1]，2016年大花型黃綠色兜蘭（Paphiopedilum Emerald Furture‘Galaxy）一舉榮獲日本世界蘭花展總冠軍。國際上兜蘭的主流商業品種也是大花型綠色和紅色的肉餅類品種。我國兜蘭市場處于起步階段，發展空間大，但在我國設施栽培生產中，大花型肉餅類兜蘭存在營養生長的生長周期過長、生長速度過慢等缺點，設施栽培周期長達3～5 a，導致生產成本較高，風險較大。因此，研究大花型肉餅類兜蘭為何葉片生長如此之慢，對提高兜蘭設施栽培效率具有重要科學意義。

葉片生長發育直接影響植株長勢和開花品質[2-3]，外界環境的變化會導致葉片的長、寬、厚度及葉表組織、葉肉組織等結構的相應變化[4-8]。目前，國內對部分中國蘭和熱帶蘭的生長發育規律進行了部分研究[9]，但有關蘭科植物葉片生長模式和形態結構的研究報道較少。李艷[10]研究發現春蘭、春劍、蓮瓣蘭和建蘭的葉片生長動態與其他植物一般生長動態相同，均呈S型生長曲線，但不同的種之間有所不同。張京偉等[11]研究發現蝴蝶蘭營養生長期間葉片總面積S與積溫T呈二次函數關系。Jin等[12]研究了4種蝴蝶蘭葉片生長曲線并建立了葉間期指數公式。在其他植物葉片生長發育規律的研究中，也有幾何參數的模型的建立[13-14]，但尚未見兜蘭葉片生長發育模型的建立。有研究發現兜蘭屬野生種因不同生境類型而對水分和光照的適應性表現出差異顯著[15]。孫安慈[16]對石斛屬、蘭屬和兜蘭屬研究，發現其表皮細胞形態、紋飾和葉肉組織分化存在差異。目前兜蘭葉片解剖結構的研究主要針對我國野生種，未見商業品種相關研究報道。

本研究以商業品種肉餅類兜蘭為試材，研究其葉片生長模式和葉片解剖結構，分析其生長規律和造成生長速度過慢的原因，以期解決目前我國兜蘭設施栽培生產中生長周期長的難題，為提高兜蘭設施栽培效率和成品率等研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試兜蘭屬品種為綠肉餅（Paphiopedilum pacific Cocoa Lovely）、紅肉餅（P. pacific In-Charm Circle），試驗于2013～2016年于山東省煙臺市農業科學研究院的連棟溫室（地理位置37°29′2″N，121°16′26″E，海拔6 m）進行。

1.2 方法

選取1 000株肉餅兜蘭瓶苗，出瓶后栽培于直徑5.67 cm透明營養缽中，基質為松樹皮（直徑3～7 mm）。在濕度80%，溫度18～28 ℃（晝）、15～18 ℃（夜），光照強度10 000～15 000 lx的條件下栽培管理。養護1 a后，將株幅大于9 cm的小苗換盆至直徑8.33 cm透明營養缽中進行中苗期養護。栽培1 a后，將株幅大于22 cm的中苗兜蘭植株換盆至直徑10 cm的透明營養缽中進行大苗期養護。

篩選50株長勢基本一致、健康無病蟲害的綠肉餅瓶苗，從兜蘭組培苗出瓶開始，每個月測量50株兜蘭每片葉片的長度、寬度和葉面積，求平均值，連續測量35個月。栽培3 a后，紅綠肉餅分別選擇10個健康樣本，以1～2 年生健康成熟葉片為試材，切割下來，洗凈擦干，用刀片、解剖針和鑷子沿靠近葉片中脈附近撕下上下表皮1.5 cm×1.5 cm，無需染色，制作徒手裝片。在OLYMPUS IX51顯微鏡下觀察切片中葉片的上下表皮和氣孔器形態。用索尼相機（NEX F3）拍照，并用測量尺和圖形分析軟件（Adobe photoshop）隨機測量10個視野中葉片的總厚度、上下表皮的厚度、上下表皮角質層的厚度、葉肉組織（柵欄組織和海綿組織）的厚度、氣孔的大小、主葉脈維管束的大小等，并對數據進行統計分析。

1.3 數據分析

用統計軟件Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0對兜蘭葉片的形態指標進行分析，繪制葉片生長曲線。其中，葉片組織結構緊密度CTR=柵欄組織厚度/葉片厚度，氣孔指數（I）的統計采用公式I=S/（E+S）×100%計算（S：氣孔數，E：表皮細胞數），氣孔密度=固定面積內氣孔個數/固定面積。單個氣孔器的面積（As）采用公式As=1/4×π×l×w計算（l：氣孔器長，w：氣孔器寬）。

2 結果與分析

2.1 兜蘭葉片生長曲線

由兜蘭的葉片生長曲線（圖1）可見，兜蘭葉片生長速度較慢，生長周期長，葉片壽命相對較長。兜蘭的葉片長度隨苗齡增大而增大，葉片生長速度呈現“慢-快-慢”的特征，葉片生長動態呈現S型生長曲線。萌發新葉的間隔時間隨苗齡增大而增長，新老葉片同時生長，新葉的發育周期隨苗齡增大而增長。小苗葉片長度小于10 cm，每30 d萌發下一片新葉，每個葉片需要90 d完成生長，葉片壽命長達480～660 d。中苗期兜蘭葉片長度10～20 cm，間隔60～90 d萌發下一片新葉，每個葉片需240～270 d才能完全停止生長，葉片壽命大于780 d。大苗期兜蘭的葉片長度大于20 cm，間隔120 d萌發下一片新葉，每個葉片需要長達300 d才能完成生長發育過程。

圖1中leaf 1～3是組織培養期間生長的葉片，組培苗出瓶后栽培于樹皮基質中，30 d后開始萌發新根，60 d開始萌發新葉。因出瓶后環境因子改變，部分能量供給根部發育，因此萌發的第一片新葉leaf 4～5的最終發育長度小于leaf 3的長度，但之后生長的葉片長度均大于組培苗期間的葉片長度，且新發葉片長度均大于老葉。leaf 4～6為小苗期發育葉片，leaf 7～10為中苗期發育葉片，leaf 11～12為大苗期發育的葉片。多數兜蘭栽培3 a后具有開花能力，并開始萌蘗新芽。生殖生長開啟后能量流動去向發生變化，更多的能量供應給生殖生長和萌蘗新芽。

圖2為兜蘭營養生長過程中葉片的長寬和面積變化曲線，雖然leaf 4、5的葉片長度小于leaf 3，但葉片寬度和葉片面積均不小于leaf 3。組培苗期間發育的葉片形狀相對細長，而溫室栽培發育的葉片形狀相對鈍圓，因此新發育的葉片即使葉長變小，但葉寬和葉面積在增長。leaf 6～11的葉面積增長斜率最大，說明兜蘭的中苗期進入快速增長階段。

2.2 大花兜蘭葉片解剖結構特征

兜蘭葉片的解剖結構見圖3、4，肉餅兜蘭為綠葉類，上下表皮細胞均無色。兜蘭氣孔器分布在下表皮中，上表皮不含氣孔。氣孔呈橢圓形，保衛細胞均無葉綠體。兜蘭的上下表皮細胞形態有區別，上表皮細胞呈現規則蜂窩狀5～7邊形，多6邊形，而下表皮細胞呈現不規則4～7邊形。由圖可見，兜蘭的上表皮細胞顯著大于下表皮細胞，厚度顯著大于下表皮細胞。表1數據表明，肉餅兜蘭葉片厚度均大于700 μm，平均厚度為777.79 μm。兜蘭上表皮細胞巨大，近中脈處最厚，占葉片總厚度的比例為30%～40%。上表皮細胞顯著大于葉肉細胞和下表皮細胞。兜蘭葉片的上表皮角質層呈乳突狀凸起，較厚，大于20 μm，下表皮角質層相對薄。柵欄組織厚度小，多為1～2層長柱形細胞。海綿組織細胞為不規則形，排列相對疏松，厚度比柵欄組織大。兜蘭的葉片組織結構緊密度相對低，其中綠肉餅的CTR值較高，紅肉餅相對較低。葉片的主葉脈發達，成龍骨狀，具有較好的支撐作用，但是其他葉脈不發達。肉餅兜蘭的氣孔屬于下生型，平均氣孔指數為17.49%，平均氣孔密度為51.47個/mm2，平均氣孔面積為2 253.49 μm2。

3 討論

兜蘭葉片生長動態同其他植物[17-18]，葉長和葉面積呈現S型增長曲線，其中苗期為營養生長快速增長期。兜蘭葉片生長周期長，從小苗到成熟苗的葉片生長周期由90 d增加至300 d。與蘭科其他花卉相比，蓮瓣蘭10 cm長葉片生長周期為170 d，建蘭12 cm長葉片生長周期為150 d，春劍18 cm長葉片的生長周期為190 d[17]，蝴蝶蘭葉片生長周期為45～50 d[11]，而兜蘭成熟葉片生長發育需時可長達240～300 d。兜蘭營養生長緩慢，對我國兜蘭產業化生產推廣、新品種培育和科研工作都是一個瓶頸問題。如何解決兜蘭生長周期過長的問題將成為今后科研工作的重點和難點。

兜蘭特殊的葉片組織結構可能是導致其營養生長速度過慢的原因。雖然兜蘭屬于C3植物[19]，但與其他典型C3植物小麥和大豆相比較，兜蘭生長速度明顯過慢。本試驗發現肉餅兜蘭葉片平均厚度為777.79 μm，分別是C3植物小麥[20]的4.21倍和大豆[21]的3.97倍。同時，兜蘭的葉片組織結構平均緊密度非常低，僅為0.17，而大豆的葉片組織結構平均緊密度可達0.53[21]。巨大的表皮細胞占了兜蘭葉片總厚度的大部分，而可以進行光合作用的葉肉細胞厚度相對過低，尤其是柵欄組織含量過低。兜蘭光合作用產生的能量合成大量的脂類，為其角質層的發育提供原材料。因此，葉肉組織，尤其是柵欄組織比例小，光合作用產物的來源減少，而巨大的表皮細胞的發育消耗了大量光合作用產物。這種特殊的葉片組織結構導致光合產能降低，可能是導致其營養生長速度過慢的原因。

兜蘭特殊的葉片組織結構具有明顯的旱生特點：葉片厚、巨大的上表皮細胞、較厚的角質層、氣孔下生型和發達的龍骨狀主葉脈。植物的葉片表皮細胞一般起保護作用，而較厚的角質層可以防止植物過分失水。兜蘭巨大的上表皮細胞可能和其他蘭科植物相同，具有儲存水分的功能[22]。兜蘭符合蘭科植物氣孔下生型特點，可使其適應于干旱環境[23]，但也減少了CO2進入葉片和在葉肉細胞中擴散的途徑。發達的龍骨狀主葉脈有較強的支撐作用，能防止葉片在失水狀態下造成物理損傷。兜蘭分布于我國西南部的喀斯特石灰巖地區，這些地區降雨豐富，但是水土易流失，土壤層淺薄、滲透性強、含水量低[24]。與旱生植物研究結果相吻合[25-27]，兜蘭特殊的葉片組織結構具有明顯的旱生特點，能保證其在水肥易流失的土壤環境中維持正常的生理代謝。

綜上所述，兜蘭營養生長速度過慢可能是由其特殊的葉片結構造成的，而其特殊的葉片結構是應對原產地干旱土壤而長期進化形成的。隨著兜蘭市場的不斷擴大，今后的研究方向在提高兜蘭葉片生長速度的栽培技術研究基礎上，展開生長發育相關的生理和分子調控機制研究，對于開發兜蘭盆花市場具有重要的理論價值和指導意義。

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